小RNA的新型检测方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种小RNA的新型检测方法及其应用。本发明专利技术揭示了新型的检测sRNA 3

【技术实现步骤摘要】
小RNA的新型检测方法及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，更具体地，本专利技术涉及小RNA的新型检测方法及其应用。

技术介绍

[0002]小RNA(sRNA)是生物体内一类重要的特殊分子，目前认为此类特殊分子能够诱导基因沉默，参与细胞生长、发育、基因转录和翻译等诸多生命活动的调控过程。
[0003]高通量测序技术的发展极大地促进了小RNA(sRNA)的发现，例如miRNA，piRNA，tsRNA(tRNA
‑
derived small RNA)，srRNA(small rDNA
‑
derived RNA)等。miRNA是一类长度在15
‑
30nt范围内的具有重要生物学调控作用的sRNA，通过和靶标RNA互补配对参与多种生物学过程。
[0004]本领域中，目前常规sRNA高通量测序文库构建策略主要是通过在sRNA的3
’
末端加上接头序列，而添加接头序列的连接反应是基于T4 RNA连接酶2。T4 RNA连接酶2可特异性地将接头序列连接到sRNA的3
’
末端
‑
OH上。
[0005]然而，鉴于目前关于sRNA 3
’
端修饰的研究尚不明确，这样的测定方法是否能够反映细胞内所存在的sRNA的全貌，在本领域中是不够清楚的。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供小RNA的新型检测方法及其应用。
[0007]在本专利技术的第一方面，提供一种检测sRNA的末端修饰的方法，所述末端修饰包括3
’‑
OH和3
’‑
cP修饰，所述方法包括：
[0008](a)提供待测sRNA，使其中存在3
’‑
OH的sRNA的3
’
端连接上标记3
’‑
OH的接头序列；
[0009](b)对(a)的产物进行脱磷酸化处理，获得5
’
端和3
’
端脱去磷酸的产物；
[0010](c)对(b)的产物进行氧化处理，使3
’‑
OH发生氧化，分离(回收)sRNA；
[0011](d)对(c)的产物进行磷酸化处理，获得携带5
’‑
P的产物；
[0012](e)使(d)的产物中存在3
’‑
cP的sRNA连接上标记3
’‑
cP的接头序列；
[0013](f)根据标记3
’‑
OH的接头序列、标记3
’‑
cP的接头序列，鉴定(f)的产物中含有3
’‑
OH和3
’‑
cP的sRNA。
[0014]在一个或多个实施方式中，(a)中，所述标记3
’‑
OH的接头序列、标记3
’‑
cP的接头序列、标记sRNA的5
’‑
接头序列的序列各不相同。
[0015]在一个或多个实施方式中，(a)或(e)中，所述接头序列为适当长度的接头序列，如5
‑
100nt，例如但不限于10、12、16、18、20、25、30nt等，优选地如16nt。
[0016]在一个或多个实施方式中，(c)中，特定长度为根据研究对象的不同而感兴趣的sRNA的长度，如10
‑
150nt，例如但不限于12、16、18、20、25、30、50、60、80、100、120nt等，优选地如16nt，优选地如15
‑
46nt的sRNA。
[0017]在一个或多个实施方式中，(a)中，利用T4 RNA连接酶2连接标记3
’‑
OH的接头序
列。
[0018]在一个或多个实施方式中，(b)中，以碱性磷酸酶(AP)进行脱磷酸化处理。
[0019]在一个或多个实施方式中，(c)中，以高碘酸钠(NaIO4)进行氧化处理。
[0020]在一个或多个实施方式中，(d)中，以T4多聚合核苷酸激酶(3
’
磷酸酶缺失)(较佳地为T4 Pnk 3
’
phosphatase minus)进行磷酸化处理。
[0021]在一个或多个实施方式中，(e)中，以RtcB连接反应连接标记3
’‑
cP的接头序列。
[0022]在一个或多个实施方式中，在(e)和(f)之间，还包括：在(e)的产物的5
’
端连接上标记sRNA的5
’‑
接头序列；较佳地，利用T4 RNA连接酶1(T4 Rnl1)连接标记sRNA的5
’‑
接头序列。
[0023]在一个或多个实施方式中，(f)中，根据标记3
’‑
OH的接头序列、标记3
’‑
cP的接头序列的存在情况(定性)/存在量(定量)，确定携带3
’‑
OH和携带3
’‑
cP的sRNA的存在情况或存在量；较佳地，标记3
’‑
OH的接头序列、标记3
’‑
cP的接头序列、标记sRNA的5
’‑
接头序列为配合规模化测序的接头序列(如携带常规sRNA测序的P5和P7高通量测序上机序列)。
[0024]在一个或多个实施方式中，(f)中，对产物进行鉴定的方法包括(但不限于)：定量PCR法，测序法，Northern blot法。
[0025]在一个或多个实施方式中，(f)后，还包括：通过高通量测序，去除所述的标记3
’‑
OH的接头序列、标记3
’‑
cP的接头序列，根据鉴定结果，建立子文库。
[0026]在一个或多个实施方式中，规模化检测(如全细胞sRNA检测)时，(a)中所述待测sRNA形成一个文库；经由所述方法进行测定后，根据(f)的鉴定结果，形成3
’‑
OH的sRNA子文库、3
’‑
cP修饰的sRNA子文库。
[0027]在一个或多个实施方式中，(a)的反应体系中包括：在待测sRNA中加入标记3
’‑
OH的接头序列(如，含有3
’‑
OH子文库条形码的App
‑
DNA12
‑
ddC接头序列)，T4 RNA连接酶反应缓冲液，PEG8000，T4 RNA连接酶2，核糖核酸酶抑制剂。较佳地，样品置于16
±
3℃或16
±
2℃或16
±
1℃孵育10
‑
20小时(如16小时)。
[0028]在一个或多个实施方式中，在(a)的反应体系反应之后，包括酶失活的步骤；较佳地，进行热失活，如在70
±
10℃热失活。
[0029]在一个或多个实施方式中，(b)的反应体系中包括：CutSmart缓冲液，核糖核酸酶抑本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测sRNA的末端修饰的方法，其特征在于，所述末端修饰包括3
’‑
OH和3
’‑
cP修饰，所述方法包括：(a)提供待测sRNA，使其中存在3
’‑
OH的sRNA的3
’
端连接上标记3
’‑
OH的接头序列；(b)对(a)的产物进行脱磷酸化处理，获得5
’
端和3
’
端脱去磷酸的产物；(c)对(b)的产物进行氧化处理，使3
’‑
OH发生氧化，分离sRNA；(d)对(c)的产物进行磷酸化处理，获得携带5
’‑
P的产物；(e)使(d)的产物中存在3
’‑
cP的sRNA连接上标记3
’‑
cP的接头序列；(f)根据标记3
’‑
OH的接头序列、标记3
’‑
cP的接头序列，鉴定(f)的产物中含有3
’‑
OH和3
’‑
cP的sRNA。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(a)中，利用T4 RNA连接酶2连接标记3
’‑
OH的接头序列；和/或(b)中，以碱性磷酸酶进行脱磷酸化处理；和/或(c)中，以高碘酸钠进行氧化处理；和/或(d)中，以T4多聚合核苷酸激酶进行磷酸化处理；较佳地该T4多聚合核苷酸激酶3
’
磷酸酶缺失，更佳地其为T4 Pnk 3
’
phosphatase minus；和/或(e)中，以RtcB连接反应连接标记3
’‑
cP的接头序列。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在(e)和(f)之间，还包括：在(e)的产物的5
’
端连接上标记sRNA的5
’‑
接头序列；较佳地，利用T4 RNA连接酶1连接标记sRNA的5
’‑
接头序列。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(f)中，根据标记3
’‑
OH的接头序列、标记3
’‑
cP的接头序列的存在情况/存在量，确定携带3
’‑
OH和携带3
’‑
cP的sRNA的存在情况或存在量；较佳地，标记3
’‑
OH的接头序列、标记3
’‑
cP的接头序列、标记sRNA的5
’‑
接头序列为配合规模化测序的接头序列。5.如权利要求1或4所述的方法，其特征在于，(f)中，对产物进行鉴定的方法包括：定量PCR法，测序法，Northern blot法；或(f)后，还包括：通过高通量测序，去除所述的标记3
’‑
OH的接头序列、标记3
’‑
cP的接头序列，根据鉴定结果，建立子文库。6.一种检测sRNA的末端修饰的方法，其特征在于，所述末端修饰包括3
’‑
OH、3
’‑
cP和3
’‑
P，所述方法包括：(1)提供待测sRNA，将其分成三组，分别以溶剂、碱性磷酸酶和T4多聚合核苷酸激酶处理：溶剂组不变，碱性磷酸酶组中，原3
’‑
P修饰的sRNA的3
’
末端转变为3
’‑
OH，T4多聚合核苷酸激酶组中，原3
’‑
P修饰和原3
’‑
cP修饰的sRNA的3
’
末端均转变为3
’‑
OH；较佳地该T4多聚合核苷酸激酶不是T4 Pnk 3
’
phosphatase minus；(2)对(1)的产物进行聚腺苷化反应，使3
’‑
OH的sRNA的3
’
端聚腺苷化：溶剂组中，仅原3
’‑
OH的sRNA的3
’
端聚腺苷化，碱性磷酸酶组中，原3
’‑
OH和原3
’‑
P修饰的sRNA的3
’
端聚腺苷化，T4多聚合核苷酸激酶组中，原3
’‑
OH、原3
’‑
P修饰和原3
’‑
cP修饰的sRNA的3
’
端聚腺苷
化；(3)对(2)的产物进行反转录反应：溶剂组中，仅原3
’‑
OH的sRNA的经3
’
端聚腺苷化的产物形成cDNA，碱性磷酸酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：翟琦巍，赖和劲，冯宁，
申请(专利权)人：中国科学院上海营养与健康研究所，
类型：发明
国别省市：