一种高精度及高覆盖度的谱系树追踪方法技术

本发明专利技术公开了一种高精度及高覆盖度的谱系树追踪方法，本发明专利技术涉及细胞谱系追踪技术领域，具体包括以下步骤：选取序列完全不同的单向RNA1、单向RNA2、单向RNA3和单向RNA4备用，选取单细胞克隆扩增制备具有13个编辑位点的谱系条形码备用；采用细胞谱系条形码技术对单向RNA1、单向RNA2、单向RNA3和单向RNA4分别与谱系条形码的13个编辑位点匹配。该高精度及高覆盖度的谱系树追踪方法，增加谱系条形码在所有细胞中的平均表达量，降低了编辑位点被消耗的速度，增加了可追踪时间，同时降低了跨位点缺失突变的比例，获得的细胞谱系树单个叶子的比例高，实现了分辨率为单个细胞级别的谱系树测定方法，降低克隆扩增中细胞的死亡率，以及细胞消化中的损失率。胞消化中的损失率。胞消化中的损失率。

【技术实现步骤摘要】
一种高精度及高覆盖度的谱系树追踪方法


[0001]本专利技术涉及细胞谱系追踪
，具体为一种高精度及高覆盖度的谱系树追踪方法。

技术介绍

[0002]追踪细胞间表型差异及进化趋势，是细胞生物学和演化生物学的基本目标之一。高通量单细胞测序的最新进展，已经使得我们能从百万个单细胞的级别描述人正常组织和肿瘤/癌症的全转录组图谱。从演化生物学的角度重新进行思考，依赖于基因表达差异比较分析得到的是细胞类型之间的相似性，而不能代表细胞有丝分裂的历史，将生物群体演化思想的“物种演化树”进一步拓展到细胞群体演化的“细胞谱系树”方法，则能够将细胞间的有丝分裂关系对应到全转录组图谱，并实现基因表达差异和有丝分裂历史间的详细比较，因而，能准确的揭示生命过程中一般规律和模式的有力武器，是细胞谱系树技术，而非单纯的单细胞全转录组图谱技术。
[0003]基于追踪细胞间有丝分裂历史而建立的细胞谱系树技术第一次在线虫中成功测定，距今已有40年左右。细胞谱系树技术发展至今，大致可以分为两类：依据光学显微镜的分析方法，依据DNA谱系条形码测序结果重构的分析方法。光学显微镜分析方法主要包括：直接观察记录绘图的方法、基于示踪染料(活体示踪染料和右旋糖酐/碳菁染料)标记的方法，基于荧光显微镜的Brainbow系列等。这类技术的优势主要是观察结果直观，但缺点也较为明显，如分辨率较低，难以对非透明的组织进行直接观察等。依据DNA谱系条形码测序结果重构的分析方法，则不受组织/胚胎透明度的限制，且由于DNA条形码的多样性非常高，故而分辨率通常远超前者。DNA条形码技术又可以分为两类：不依赖DNA突变的Clonal barcode技术和依赖DNA突变的Lineage barcode技术。Clonal barcode技术主要应用于高通量的追踪单个祖细胞的增殖速率或分化命运，而不关心其后代细胞之间的谱系关系。Lineage barcode技术应用于追踪同一起源的后代细胞之间的谱系关系，其中较成功的是基于CRISPR/Cas9随机插入和缺失突变的GESTALT、CARLIN技术等。虽然Clonal barcode和Lineage barcode技术相结合，成功在肺癌细胞增殖和转移过程中实现了高通量追踪单细胞级别的细胞谱系关系图谱，然而过低的分辨率/覆盖度使得该数据不足以应用树的比对方法(排除共同祖先对子细胞间基因表达相关性及表型相关性的影响)来进行基因表达差异和有丝分裂历史的详细比较。
[0004]根据上述说明，现有技术谱系树的精度及对原始细胞群体的覆盖度均较低，对整个细胞群体的有丝分裂历史的追踪存在较大程度的缺失，其导致原因为：用于测序的细胞数量太少，降低谱系树对细胞群体的覆盖度；用于谱系追踪的lineage barcode表达量过低，在单细胞测序中丢失，进一步降低了谱系树的覆盖度；大部分lineage barcode含有跨越编辑位点的长缺失突变，这将降低可以继续编辑的位点数目，并可能剪掉已经发生的编辑事件，降低了谱系树的精度；大部分位点通常在2
‑
4天内被编辑完毕，谱系追踪时间过短；lineage barcode的大部分基因型均存在于多个细胞中，无法区分，这限制了依赖树的单细
胞表达差异比较。

技术实现思路

[0005](一)解决的技术问题
[0006]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种高精度及高覆盖度的谱系树追踪方法，解决了现有技术谱系树的精度及对原始细胞群体的覆盖度均较低，对整个细胞群体的有丝分裂历史的追踪存在较大程度的缺失问题。
[0007](二)技术方案
[0008]为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：一种高精度及高覆盖度的谱系树追踪方法，具体包括以下步骤：
[0009]S1、选取序列完全不同的单向RNA1、单向RNA2、单向RNA3和单向RNA4备用，选取单细胞克隆扩增制备具有13个编辑位点的谱系条形码备用；
[0010]S2、采用细胞谱系条形码技术对单向RNA1、单向RNA2、单向RNA3和单向RNA4分别与谱系条形码的13个编辑位点匹配，得到谱系条形码序列；
[0011]S3、将S1所述的谱系条形码与绿色荧光蛋白基因及抗性基因组成一个融合基因；
[0012]S4、采用单细胞测序平台捕获S3所述具有融合基因的谱系条形码。
[0013]优选的，在步骤S1中，单细胞为单个HEK293细胞，单个HEK293细胞连续分裂下克隆扩增10天得到谱系条形码。
[0014]优选的，在步骤S2中，所述单向RNA1与谱系条形码的13个编辑位点中2个以上的编辑位点错配，降低了跨位点缺失突变的比例，增加了可追踪的时间；获得的细胞谱系树单个叶子的比例高，实现了分辨率为单个细胞级别的谱系树测定方法。
[0015]优选的，在步骤S2中，所述单向RNA2、单向RNA3和单向RNA4分别与谱系条形码的第9、12和13编辑位点匹配，编辑位点第9、12和13的匹配编辑效率较低。
[0016]优选的，在步骤S2中，跟据错配碱基数量及碱基类型的差异，单向RNA1、单向RNA2与谱系条形码的13个编辑位点的编辑效率逐渐降低，降低跨位点缺失突变的比例。
[0017]优选的，在步骤S2中，依据CFD技术打分策略，谱系条形码跨编辑位点缺失突变的比例为8.8％，且单细胞叶子的比例为90％。
[0018]优选的，在步骤S3中，采用高浓度的抗生素筛选融合基因，有利于筛选到融合基因表达更高的细胞克隆。
[0019]优选的，在步骤S3中，绿色荧光蛋白基因亮度的观测有利于筛选到该融合基因表达更高的样品。
[0020]优选的，在步骤S4中，通过单细胞测序平台捕获具有融合基因的谱系条形码的概率约为90％。
[0021]有益效果
[0022]本专利技术提供了一种高精度及高覆盖度的谱系树追踪方法。与现有技术相比具备以下有益效果：
[0023]1、该高精度及高覆盖度的谱系树追踪方法，提高了谱系树的精度，增加谱系条形码在所有细胞中的平均表达量，谱系条形码的13个编辑位点和单向RNA均存在2个以上的错配，降低了编辑位点被消耗的速度，增加了可追踪时间，同时降低了跨位点缺失突变的比
例，获得的细胞谱系树单个叶子的比例高，实现了分辨率为单个细胞级别的谱系树测定方法。
[0024]2、该高精度及高覆盖度的谱系树追踪方法，提高了谱系树的覆盖度，降低克隆扩增中细胞的死亡率，以及细胞消化中的损失率，且所有单细胞均应用于细胞谱系追踪。
附图说明
[0025]图1为本专利技术谱系追踪系统所包含的基因结构示意图；
[0026]图2为本专利技术的单个细胞连续培养的细胞状态观测示意图；
[0027]图3为本专利技术的同时捕获谱系条形码及转录组数据的实验流程图；
[0028]图4为本专利技术的单个细胞中谱系条形码的表达量的谱系树质量参数验证图；
[0029]图5为本专利技术的谱系树精确度示例图；
[0030]图6为本专利技术的祖先条形本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高精度及高覆盖度的谱系树追踪方法，其特征在于：具体包括以下步骤：S1、选取序列完全不同的单向RNA1(1)、单向RNA2(2)、单向RNA3(3)和单向RNA4(4)备用，选取单细胞克隆扩增制备具有13个编辑位点的谱系条形码(5)备用；S2、采用细胞谱系条形码技术对单向RNA1(1)、单向RNA2(2)、单向RNA3(3)和单向RNA4(4)分别与谱系条形码(5)的13个编辑位点匹配，得到谱系条形码(5)序列；S3、将S1所述的谱系条形码(5)与绿色荧光蛋白基因及抗性基因组成一个融合基因；S4、采用单细胞测序平台捕获S3所述具有融合基因的谱系条形码(5)。2.根据权利要求1所述的一种高精度及高覆盖度的谱系树追踪方法，其特征在于：在步骤S1中，单细胞克隆扩增时长为10天。3.根据权利要求1所述的一种高精度及高覆盖度的谱系树追踪方法，其特征在于：在步骤S2中，所述单向RNA1(1)与谱系条形码(5)的13个编辑位点中2个以上的编辑位点错配。4.根据权利要求1所述的一种高精度及高覆盖度的谱系树追踪方法，其特征在于：在步骤S2中，所述单向RNA2(...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨建荣，陈小舒，陈锋，李梓樟，张晓玉，吴鹏，杨文静，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：