LacI突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了LacI突变体及其应用，属于生物技术领域。本发明专利技术中所述LacI突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2、3或4所示。本发明专利技术在LacIQ突变体基础上，通过定向进化筛选获得LacI调控蛋白突变体，该突变体可增强与DNA序列结合能力，从而降低本底渗漏表达(低于野生型渗漏表达的5％)，同时将上述突变体用于制备高效生物传感器同样也能取得较好的效果。传感器同样也能取得较好的效果。传感器同样也能取得较好的效果。

【技术实现步骤摘要】
LacI突变体及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及LacI突变体及其应用。

技术介绍

[0002]作为研究最深入广泛的微生物，大肠杆菌具有两个显著特征：操作简单和能在廉价培养基中实现高密度培养，因此大肠杆菌表达系统是高效表达异源蛋白最常用的原核表达系统。尽管大肠杆菌有众多优点，但并非每一种基因都能在其中有效表达。这归因于每种基因都有其独特的结构、mRNA的稳定性和翻译效率、蛋白质折叠的难易程度、宿主细胞蛋白酶对蛋白质的降解、外源基因、在密码子利用上的主要差别以及蛋白质对宿主的潜在毒性等。
[0003]乳糖启动子(Lac)是大肠杆菌中最早发现、应用最为广泛的启动子。其工作机制是当无有小分子诱导物(如乳糖及其类似物)时调控蛋白LacI结合于操纵基因lacO，从而阻遏转录起始；而当诱导物存在时，可与LacI蛋白相结合，从而从lacO序列解离，开启转录。乳糖启动子也衍生出Tac、Trc等启动子，并参与构建T7高表达系统。但Lac系列启动子的问题之一在于不加入诱导剂(如异丙基硫代半乳糖苷(IPTG))时，该系统的本底渗漏表达较高。这一缺点可能造成宿主细胞代谢负担，不利于异源蛋白尤其是毒性蛋白的表达。而利用该系统构建代谢通路时，渗漏表达将导致对代谢流的不精准调控，造成胞内资源的浪费，不适用于优化代谢模块配比。
[0004]现有的方式是通过突变LacI调控蛋白启动子区，获得启动强度提升的LacIQ突变体，可显著降低本底渗漏表达。但LacI蛋白本身固有特性，如与lacO DNA序列结合等特性，不是仅仅通过增加其表达量即可解决的。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的之一在于提供一种LacI突变体，所述LacI突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2、3或4所示。
[0006]本专利技术的目的之二在于提供一种表达盒，所述表达盒含有上述LacI突变体。
[0007]本专利技术的目的之三在于提供一种表达载体，所述表达载体含有上述LacI突变体或表达盒。
[0008]进一步地，所述表达载体为重组质粒。
[0009]更进一步地，所述重组质粒为pET
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22a(+)、pET
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22b(+)、pET
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3a(+)、pET
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3d(+)、pET
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11a(+)、pET
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12a(+)、pET
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14b、pET
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15b(+)、pET
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16b(+)、pET
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17b(+)、pET
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19b(+)、pET
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20b(+)、pET
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21a(+)、pET
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23a(+)、pET
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23b(+)、pET
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24a(+)、pET
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25b(+)、pET
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26b(+)、pET
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27b(+)、pET
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28a(+)、pET
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29a(+)、pET
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30a(+)、pET
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31b(+)、pET
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32a(+)、pET
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35b(+)、pET
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38b(+)、pET
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39b(+)、pET
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40b(+)、pET
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41a(+)、pET
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41b(+)、pET
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42a(+)、pET
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43a(+)、pET
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43b(+)、pET
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44a(+)、pET
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49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET
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A、pRSET
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B、pRSET
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C、pGEX
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5X
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1、pGEX
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6p
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1、pGEX
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6p2、pBV220、pBV221、
pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232
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8、pUC
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18或pUC
‑
19。
[0010]本专利技术的目的之四在于提供一种重组宿主细胞，所述重组宿主细胞含有上述LacI突变体。
[0011]进一步地，所述重组宿主细胞为大肠杆菌BW25113ΔlacI、谷氨酸棒杆菌、恶臭假单胞菌或枯草芽孢杆菌。
[0012]本专利技术的目的之五在于提供一种增强目的基因表达的方法，所述方法包括将上述LacI突变体与目的基因可操作地连接。
[0013]本专利技术的目的之六在于提供上述LacI突变体在制备生物传感器中的应用。
[0014]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0015]本专利技术在LacIQ突变体基础上，通过定向进化筛选获得LacI调控蛋白突变体，该突变体可增强与DNA序列结合能力，从而降低本底渗漏表达(低于野生型渗漏表达的5％)。
附图说明
[0016]图1a为实施例1中LacI突变体(M7、N246S和I79T)与LacI野生型诱导曲线图。
[0017]图1b为实施例1中LacI突变体(M7、N246S和I79T)与LacI野生型诱导柱状图。
[0018]图2为实施例2中LacI野生型(WT)和突变体N246S分别调控两种荧光蛋白RFP和GFP表达对比图。
[0019]图3为实施例3中LacI野生型(WT)和突变体M7调控pET28a T7启动子表达异源蛋白的对比结果。
[0020]图4为实施例4中LacI野生型(浅灰)和突变体M7(深灰)调控荧光蛋白在谷氨酸棒杆菌中表达的对比结果。
[0021]图5为实施例4中LacI野生型(浅灰)和突变体M7(深灰)调控荧光蛋白在恶臭假单胞菌中表达的对比结果。
[0022]图6为实施例4中LacI野生型(浅灰)和突变体M7(深灰)调控荧光蛋白在枯草芽孢杆菌中表达的对比结果。
[0023]图7为实施例5中基于LacI突变体M7构建的生物传感器筛选LacS转糖基活性突变体，其中(A)筛选获得几种LacS突变体与野生型(WT)在不加入底物乳糖(
‑
)、加入底物乳糖(+)荧光蛋白GFP数值，及生成的低聚半乳糖(GOS)含量比较；最佳突变体LasS S5
‑
11与野生型(WT)体内(B)、体外(C)在37℃和70℃下酶活比较结果。
具体实施方式
[0024]实施例1
[0025]LacI野生型序列SEQ ID NO.1：
[0026]MKPVTLYDVAE本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种LacI突变体，其特征在于，所述LacI突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2、3或4所示。2.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒含有权利要求1所述的LacI突变体。3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求1所述的LacI突变体或权利要求2所述的表达盒。4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为重组质粒。5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述重组质粒为pET
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22a(+)、pET
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22b(+)、pET
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3a(+)、pET
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3d(+)、pET
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11a(+)、pET
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12a(+)、pET
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14b、pET
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15b(+)、pET
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16b(+)、pET
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17b(+)、pET
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19b(+)、pET
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20b(+)、pET
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21a(+)、pET
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23a(+)、pET
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23b(+)、pET
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24a(+)、pET
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25b(+)、pET
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26b(+)、pET
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27b(+)、pET
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28a(+)、pET
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29a(+)、pET
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30a(+)、pET
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31b(+)、pET
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32a(+)、p...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁朝宁，吴结缘，唐双焱，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：