一种通过生物发酵生产葡萄糖醛酸的方法技术

本发明专利技术公开一种通过生物发酵生产葡萄糖醛酸的方法，涉及生物制备技术领域。包括以下步骤：培养重组工程菌，获得种子液；将所述种子液接种到发酵罐培养基中进行发酵培养，经补料控制和诱导控制得到发酵液；将所述发酵液通过离心或膜过滤得到湿菌体；将所述湿菌体加入反应液中进行转化，得到葡萄糖醛酸。本发明专利技术通过控制发酵过程和转化过程的参数，尤其是通过控制培养基的组分以及在发酵过程中采用补料控制和诱导控制，得到了位于湿菌体中的高活性、高稳定性和高含量的肌醇氧化酶，进而促进了转化过程中肌醇的转化率，提高了产物中葡萄糖醛酸的浓度。采用本方案，肌醇转化率能达到95％以上，得到的葡萄糖醛酸含量大于76g/L，同时肌醇氧化酶可以重复利用。醇氧化酶可以重复利用。

【技术实现步骤摘要】
一种通过生物发酵生产葡萄糖醛酸的方法


[0001]本专利技术涉及生物制备
，特别涉及一种通过生物发酵生产葡萄糖醛酸的方法。

技术介绍

[0002]肌醇又称环己六醇、六羟基环己烷、环己糖醇、肉肌糖、不旋肌醇，分子式为C6H
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O6，分子量为180，属于B族维生素之一，因羟基相对环平面的取向不同，共有9种异构体，其中7种为非旋光体，2种为旋光体(左旋体和右旋体)。肌醇广泛分布在动物和植物体内，是动物、微生物的生长因子。主要用于治疗肝硬变、肝炎、脂肪肝、血中胆固醇过高等症。由于肌醇是人、动物与微生物生长的必需物质，使其在饲料、医药、食品等领域有重要的应用。
[0003]葡萄糖醛酸(D
‑
glucuronic acid)，简称葡醛酸(GlcUA)，分子式C6H
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O7，分子量为194.14。葡萄糖醛酸作为一种生物解毒剂，在动物肝脏中能与含有羟基、氨基、羧基、巯基等基团的内源性和外源性有毒物质结合，提高有毒物质的水溶性，最终以葡萄糖醛酸酯、葡萄糖醛酸盐或配合物的形式排出体外，起到解毒作用。此外，葡醛酸已被证明具有防治皮肤炎症、降低血液中胆固醇及甘油三酯浓度的功能，使其被广泛应用于饮料、食品及化妆品行业。葡萄糖醛酸衍生物葡萄糖醛酸内酯俗称肝泰乐，是一种肝脏解毒剂和免疫调节剂，可用于肝脏疾病治疗、食物药物解毒以及风湿类风湿性关节炎的辅助治疗。上述的应用，使葡萄糖醛酸每年的需求量递进式增长。
[0004]传统的葡萄糖醛酸的生产方法主要为多糖水解法和化学氧化催化法。其中，多糖水解法是指通过水解含糖醛酸的多糖得到葡萄糖醛酸的过程，例如，从太阳花膜半纤维素的水溶性部分得到葡萄糖醛酸；用碱水解棉花和纤维素、用热水萃取全纤维素、氯水溶液氧化纤维素等方法来制备醛酸；但在多糖水解法中，连接糖醛酸的苷键一般稳定性高，水解困难，因此，水解过程需要用强酸碱，而在强酸碱条件下，产物葡萄糖醛酸往往被分解，产生氧化选择性差、副产物多且产品收率低等缺陷，不能满足生产需要。化学氧化法是指用无机试剂氧化糖类及其衍生物来生产葡萄糖醛酸，以硝酸氧化法生产葡萄糖醛酸的应用最为广泛，该方法的过程是：首先用浓硝酸氧化淀粉得到粗淀粉氧化液，之后在酸性条件下加热加压水解粗淀粉氧化液，将所得的水解液进行减压浓缩，同时加入醋酸酯化，最后冷冻结晶制备得到葡萄糖醛酸内酯，然而该方法的总收率较低(约10％)且存在能耗高、选择性差、环境污染严重等缺陷，使得该方法仍不能满足生产需求。
[0005]随着人们对微生物认识的提高，生物催化法生产葡萄糖醛酸的研究日益增多，例如：人类羊膜中存在UDP
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葡萄糖脱氢酶，可以催化UDP
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葡萄糖生成UDP
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葡萄糖醛酸，UDP
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葡萄糖醛酸在相关酶的作用下进一步合成葡萄糖醛酸。相较于多糖水解法和化学氧化法，生物催化法具有高效性、反应条件温、安全性高及废物排放少的优点。
[0006]肌醇氧化酶是促进肌醇转化为葡萄糖醛酸的一种酶，然而。该酶稳定性较差，容易导致转化过程中会发生转化不完全的现象，最终导致以肌醇氧化酶生产葡萄糖醛酸时产生
产物浓度和转化率偏低的问题。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种通过生物发酵生产葡萄糖醛酸的方法，用于克服本领域中因肌醇氧化酶稳定性较差，导致转化过程中会发生转化不完全的现象，最终导致的以肌醇氧化酶生产葡萄糖醛酸时产物浓度和转化率偏低的问题。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：本专利技术提供一种通过生物发酵生产葡萄糖醛酸的方法，包括以下步骤：
[0009](1)培养重组工程菌，获得种子液；
[0010](2)将所述种子液接种到发酵罐培养基中进行发酵培养得到发酵液；
[0011](3)将所述发酵液通过离心或膜过滤收集得到湿菌体；
[0012](4)将所述湿菌体加入反应液中进行转化，得到葡萄糖醛酸；
[0013]其中，所述步骤(2)中包括：在将所述种子液接种到发酵罐培养基中培养后，进行补料控制和诱导控制。
[0014]本专利技术提供的通过生物发酵生产葡萄糖醛酸的方法包括：培养重组工程菌，获得种子液；将所述种子液接种到发酵罐培养基中进行发酵培养，经补料控制和诱导控制得到发酵液；将所述发酵液通过离心或膜过滤收集得到湿菌体；将所述湿菌体加入反应液中进行转化，得到葡萄糖醛酸。本专利技术的方法通过控制发酵过程和转化过程的参数，尤其是通过控制培养基的组分(种子罐培养基和发酵罐培养基)以及在发酵过程中采用补料控制，促进了工程菌的优异表达，得到了位于湿菌体中的高活性、高稳定性和高含量的肌醇氧化酶，进而促进了转化过程中肌醇的转化率，提高了产物中葡萄糖醛酸的浓度。采用本专利技术中葡萄糖醛酸的制备方法，提高了转化率，肌醇转化率能达到95％以上；得到的葡萄糖醛酸含量为76g/L，降低了提取难度；同时肌醇氧化酶可以重复利用，降低了生产成本。
具体实施方式
[0015]为了使本专利技术所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0016]本专利技术提供一种通过生物发酵生产葡萄糖醛酸的方法，包括以下步骤：
[0017](1)培养重组工程菌，获得种子液；
[0018](2)将所述种子液接种到发酵罐培养基中进行发酵培养得到发酵液；
[0019](3)将所述发酵液通过离心或膜过滤收集得到湿菌体；
[0020](4)将所述湿菌体加入反应液中进行转化，得到葡萄糖醛酸。
[0021]本专利技术对重组工程菌进行培养，获得种子液。在本专利技术中，所述重组工程菌的培养包括一级种子培养和二级种子培养两个步骤，所述一级种子培养包括将重组工程菌接种于LB培养基中，并在200
‑
240rpm、34
‑
40℃条件下培养5
‑
6h。本专利技术中的重组工程菌为外购得到，购买来源为中国科学院微生物研究所；该菌也已申请专利并获得专利授权，申请号为CN201710790108.9。应当理解的是，本专利技术中真正将肌醇催化转化为葡萄糖醛酸的物质并不是重组工程菌本身，而是由工程菌中功能蛋白表达产生的肌醇氧化酶。本专利技术中对LB培
养基并无特殊要求，LB培养基是本
公知的培养基，本方案中可以选择市售的任意LB培养基。本专利技术对一级种子培养的容器/器皿并无特殊要求，能实现振荡培养的相应容器或器皿均可；优选采用摇瓶进行。本专利技术中对振荡的方式并无特殊要求，优选采用摇床或振荡器进行，更优选为摇床。本专利技术中振荡培养的速率优选为200
‑
240rpm，更优选为220rpm。本专利技术中的培养温度优选为34
‑
40℃，更优选为37℃。本专利技术中的培养时间优选为5
‑
6h，更优选为5h。应当理解的是，本专利技术中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通过生物发酵生产葡萄糖醛酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)培养重组工程菌，获得种子液；(2)将所述种子液接种到发酵罐培养基中进行发酵培养得到发酵液；(3)将所述发酵液通过离心或膜过滤收集得到湿菌体；(4)将所述湿菌体加入反应液中进行转化，得到葡萄糖醛酸；其中，所述步骤(2)中包括：在将所述种子液接种到发酵罐培养基中培养后，进行补料控制和诱导控制。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中种子液的培养过程包括：A.一级种子培养：将所述重组工程菌接种于LB培养基中，在200
‑
240rpm、34
‑
40℃条件下培养5
‑
6h；B.二级种子培养：在OD
600
＝2
‑
3时，接种至种子罐培养基进行培养，待OD
600
达到2
‑
3时完成种子培养获得所述种子液；所述种子罐培养基的具体组成为：葡萄糖1wt％
‑
2wt％，磷酸二氢钾1wt％
‑
2wt％，硫酸镁0.05wt％
‑
0.08wt％，柠檬酸0.1wt％
‑
0.2wt％，硫酸铵0.4wt％
‑
0.6wt％，微量元素1000
‑
1500mg/L，消泡剂0.05
‑
0.15ml/L，余量为水；所述二级种子培养的条件如下：温度：34
‑
40℃；风量：0.4
‑
0.6m3/h；转速：280
‑
320rpm；压力：0.01
‑
0.03MPa；pH：氨水调节至pH7.0
±
0.1；溶氧量：20
‑
30％。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的发酵培养经36
‑
40h，OD
600
保持稳定时结束，得到所述发酵液；所述发酵罐培养基的具体组成为：葡萄糖1wt％
‑
2wt％，磷酸二氢钾1wt％
‑
2wt％，硫酸镁0.05wt％
‑
0.08wt％，柠檬酸0.1wt％
‑
0.2wt％，硫酸铵0.4wt％
‑
0.6wt％，微量元素1000
‑
1500mg/L，消泡剂0.05
‑
0.15ml/L，余量为水；所述发酵培养条件如下：温度：34
‑
40℃；风量：1.2
‑
1.8m3/h；转速：18...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱理平，廖飞，郑斌华，魏萍萍，
申请(专利权)人：诸城市浩天药业有限公司，
类型：发明
国别省市：