β-葡萄糖苷酶Lf18920在特异水解藏红花苷-1得藏红花酸单糖苷衍生物中的应用制造技术

本发明专利技术公开了β

【技术实现步骤摘要】
β
‑
葡萄糖苷酶Lf18920在特异水解藏红花苷
‑
1得藏红花酸单糖苷衍生物中的应用


[0001]本专利技术涉及酶的基因工程
，具体涉及β
‑
葡萄糖苷酶Lf18920在特异水解藏红花苷
‑
1得藏红花酸单糖苷衍生物臧花苷
‑
4和藏红花苷
‑
5中的应用。

技术介绍

[0002]藏红花苷(又称西红花苷)是名贵药材藏红花的主要功能成分，主要存在于藏红花、栀子果实等植物中。藏红花苷具有治疗心血管疾病及预防动脉粥样硬化、治疗中枢神经疾病、抗肿瘤、抗炎、抗糖尿病、保肝利胆等诸多功效。藏红花苷在阿尔兹海默症、帕金森病、心脏血管疾病、癌症等疾病的预防与治疗中具有一定作用(韩宇,谢国勇,李冉,黄丽桃,秦民坚.西红花苷药理活性的研究进展[J].现代药物与临床,2017,32(09):1806
‑
1814.)。
[0003]藏红花苷是由藏红花酸和葡萄糖或龙胆二糖结合而成的一系列酯类化合物。藏红花苷根据糖苷键数量及种类可分为：藏红花苷
‑
1、藏红花苷
‑
2、藏红花苷
‑
3、藏红花苷
‑
4、藏红花苷
‑
5及无糖苷的藏红花酸。藏红花、栀子中藏红花苷主要以藏红花苷
‑
1的形式存在。但药物代谢研究表明由于两端龙胆二糖的存在影响了藏红花苷
‑
1在体内的吸收，小鼠口服藏红花苷
‑/>1后，血液中的藏红花类化合物主要以单糖苷的藏红花苷
‑
4、藏红花苷
‑
5或无糖苷的藏红花酸存在，推测这些化合物是体内发挥其生物学功能的主要成分(Akira A.et al.Orally Administered Crocetin and Crocins Are Absorbed into Blood Plasma as Crocetin and Its Glucuronide Conjugates in Mice J.Agric.Food Chem.2005,53,18,7302
–
7306)。最近的研究表明藏红花酸单糖苷衍生物具有更好的神经元保护、抗氧化和抗癌活性(Zhu A.L.et al.Characterization of Crocetin
‑
Monoglucuronide as aNeuron
‑
Protective Metabolite of Crocin
‑
1.[J].Molecular nutrition&food research,2019.)。
[0004]植物中主要以藏红花苷
‑
1形式存在，单糖苷的藏红花苷
‑
4和藏红花苷
‑
5很难通过纯化从植物中提取获得。其资源匮乏、价格昂贵且化学提取需消耗大量有机化学试剂，分离纯化费时费力，极大限制了藏红花苷的药物开发和临床应用。目前选择性合成藏红花苷的研究较少，Fangyu Ding的团队首次利用微生物糖基转移酶将藏红花酸转化成藏红花苷
‑
4和藏红花苷
‑
5(Ding Fangyu,Liu Feng,Shao Wenming,Chu Jianlin,Wu Bin,He Bingfang.Efficient synthesis of crocins fromcrocetin by a microbial glycosyltransferase from Bacillus subtilis 168.[J].Journal of agricultural and food chemistry,2018,66(44)：11701
–
11708)。何冰芳等公开一种微生物源葡萄糖基转移酶可以定向合成藏红花单葡萄糖酯(藏红花苷
‑
5)(何冰芳,丁方宇,刘峰,邵文明,王广基,阿基业,谭朝艺,储建林,吴斌.一种葡萄糖基转移酶及在合成藏红花酸葡萄糖酯中的应用[P].中国：CN106906192B,2020
‑
10
‑
30.)。但利用葡萄糖基转移酶合成藏红花酸单糖苷衍生物，需要将藏红花苷
‑
1水解成藏红花酸，以尿苷二磷酸葡萄糖作为糖基化的供体，若使该反应连续进行需要与尿苷二磷酸葡萄糖体系再生偶联，同时藏红花酸水溶性差，增加了利
用该酶进行工业化大规模生产的难度。
[0005]β
‑
葡萄糖苷酶(β
‑
glucosidase；EC3.2.1.21)，可以用于水解结合在非还原性末端的β
‑
葡萄糖苷键，生成β
‑
葡萄糖苷和相应的配位基。β
‑
葡萄糖苷酶可以直接水解水溶性的藏红花苷
‑
1，但已发现的β
‑
葡萄糖苷酶一般都直接将藏红花苷
‑
1水解成藏红花酸，很难通过控制其酶解条件获得藏红花酸单糖苷衍生物。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供β
‑
葡萄糖苷酶Lf18920在特异水解藏红花苷
‑
1得藏红花酸单糖苷衍生物臧花苷
‑
4和藏红花苷
‑
5中的应用，以解决现有技术的不足。
[0007]本专利技术采用以下技术方案：
[0008]β
‑
葡萄糖苷酶Lf18920在特异水解藏红花苷
‑
1得藏红花酸单糖苷衍生物臧花苷
‑
4和藏红花苷
‑
5中的应用，所述β
‑
葡萄糖苷酶Lf18920由leifsonia sp.ZF2019的IT072_18920基因简称Lf18920基因所编码。
[0009]进一步地，所述Lf18920基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，全长2700bp；其编码的β
‑
葡萄糖苷酶Lf18920氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0010]进一步地，所述Lf18920基因按照以下方法获得：以leifsonia sp.ZF2019的全基因组为模板，以18920F和18920R为引物，经PCR扩增获得所述Lf18920基因；其中，18920F核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，18920R核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0011]进一步地，所述β
‑
葡萄糖苷酶Lf18920重组表达通过如下方式进行：PCR扩增Lf18920基因，以pET
‑
28a
‑
HMT为载体构建表达质粒，在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达，用Ni
‑
NTA柱纯化表达蛋白。
[0012]进一步地，β
‑
葡本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.β
‑
葡萄糖苷酶Lf18920在特异水解藏红花苷
‑
1得藏红花酸单糖苷衍生物臧花苷
‑
4和藏红花苷
‑
5中的应用，其特征在于，所述β
‑
葡萄糖苷酶Lf18920由leifsonia sp.ZF2019的IT072_18920基因简称Lf18920基因所编码。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Lf18920基因核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，全长2700bp；其编码的β
‑
葡萄糖苷酶Lf18920氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Lf18920基因按照以下方法获得：以leifsonia sp.ZF2019的全基因组为模板，以18920F和18920R为引物，经PCR扩增获得所述Lf18920基因；其中，18920F核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，18920R核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述β
‑
葡萄糖苷酶Lf18920重组表达通过如下方式进行：PCR扩增Lf18920基因，以pET
‑
28a
‑
HMT为载体构建表达质粒，在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达，用Ni<...

【专利技术属性】
技术研发人员：许光治，王茜，张有做，倪勤学，王艳，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：