一种高效联产D-阿洛酮糖和葡萄糖酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种高效联产葡萄糖酸和D

【技术实现步骤摘要】
pyogenes的NADH氧化酶NOX基因。
[0008]所述重组大肠杆菌A按以下方法构建：将来源于Bacillus sp.的葡萄糖异构酶基因gi以及来源于Clostridium bolteae ATCCBAA
‑
613的D
‑
阿洛酮糖
‑3‑
差向异构酶基因dpe连接在pRSFDuet
‑
1上，得到重组质粒pRSFDuet
‑
gi
‑
dpe；将来源于Providencia alcalifaciens的rdh基因片段以及来源于枯草WB800的GDH基因片段其连接在pETDuet
‑
1表达载体得到质粒pETDuet
‑
gdh
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rdh；再将重组质粒pRSFDuet
‑
gi
‑
dpe和重组质粒pETDuet
‑
gdh
‑
rdh转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中，得到重组大肠杆菌Ec/pRgd
‑
pEgr；在重组大肠杆菌Ec/pRgd
‑
pEgr的基础上，过表达大肠杆菌中的NAPRTase和NAD
+
Syn的编码基因pncB和nadE。
[0009]所述重组大肠杆菌A湿菌体按以下操作进行制备：将重组大肠杆菌A接种到LB培养基中培养，采用诱导剂IPTG在20℃条件下诱导24h,收集得到湿菌体。
[0010]所述的将重组大肠杆菌A接种到LB培养基中培养的接种量为：5ml菌液/50mlLB培养基。
[0011]所述的LB培养基按以下组分制备：5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨、10g/L氯化钠，并且pH为7.0。
[0012]所述重组大肠杆菌B按以下方法构建：将来源于Rubrivivax sp.的糖醇脱氢酶基因sdh以及来源于Streptococcus pyogenes的NADH氧化酶基因nox连接在pRSFDuet
‑
1上，得到重组质粒pRSFDuet
‑
sdh
‑
nox。
[0013]所述全细胞催化反应条件为，底物浓度为20～50g/L，反应温度为30
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50℃，反应时间12
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18h，pH是7
‑
8.5，Co
2+
的添加量为：1mMol/L，烟酸的添加量为40mg/L。
[0014]重组大肠杆菌B催化反应条件为pH＝7，添加0.2mM NAD+。
[0015]本专利技术的有益效果如下：
[0016]本专利技术在重组大肠杆菌构建时创新性的以葡萄糖脱氢酶(GDH)与核糖醇脱氢酶(RDH)偶联构建辅酶循环系统以提高细胞生产过程中所需的NADH的再生效率，同时，结合引入nadE和pncB构建NAD+补偿途径，将烟酸转化为NAD+,胞内NAD(H)含量提高了120.3％。通过催化过程优化，蒜糖醇产量达到16.72g/L，蒜糖醇转化为D
‑
阿洛酮糖产率15.07g/L。
[0017]本专利技术以D
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葡萄糖为底物进行转化，D
‑
葡萄糖作为自然界中一种成本低廉、易获得的单糖，相对于常规合成D
‑
阿洛酮糖所用的果糖，能有效降低制备成本。
附图说明
[0018]图1为本专利技术的工艺流程图；
[0019]图2为本专利技术的反应流程图；
[0020]图3为对实施例1条件下D
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阿洛酮糖液相图；
[0021]图4为对实施例1条件下葡萄糖酸液相图。图中：GI:葡萄糖异构酶；DPE:D
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阿洛酮糖
‑3‑
差向异构酶；RDH:核糖醇脱氢酶；GDH:葡萄糖脱氢酶；SDH:糖醇脱氢酶；NOX:NADH氧化酶。
具体实施方式
[0022]下面结合实施例对本专利技术做进一步说明。若未特别指明，实施例中所用技术手段
为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0023]本专利技术实施例中所用到的原料和试剂均为常规化学试剂，均能通过商业渠道购买得到。
[0024]实施例1
[0025]本实施例是高效联产葡萄糖酸和D
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阿洛酮糖的方法的一个实施实例，具体步骤如下：
[0026](1)重组大肠杆菌的构建：
[0027]重组质粒pRSFDuet
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gi
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dpe的构建：以来源于Bacillus.sp的葡萄糖异构酶基因gi基因片段和来源于ClostridiumbolteaeATCCBAA
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613的D
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阿洛酮糖
‑3‑
差向异构酶基因dpe基因片段为模板，以gi
‑
F：
[0028]ccacagccaggatccgaattcaatgagcctgaccaccg(BamHI)为上游引物，gi
‑
R：taagcattatgcggccgcaagcttttaaccacgcgc(HindIII)为下游引物进行PCR扩增，扩增得到目的片段gi；以dpe
‑
F：
[0029]atatacatatggcagatctaatgcgttacttcaaagaagaagtt(BamHI)为上游引物，dpe
‑
R：gtttctttaccagactcgagttagataccgaaaacgtgcctaca(HindIII)为下游引物进行PCR扩增，扩增得到目的片段dpe。通过用限制性内切酶BamHI和HindIII对质粒pRSFDuet
‑
1在37℃进行双酶切，再用无缝克隆试剂盒分别将目的基因gi和dpe与表达载体pRSFDuet
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1的多克隆位点MCS1和MCS2进行重组连接，得到重组质粒pRSFDuet
‑
gi
‑
dpe。
[0030]重组质粒pETDuet
‑
gdh
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rdh的构建：以来源于Providencia alcalifaciens的rdh基因片段为模板，以rdh
‑
F：
[0031]atatacatatggcagatctgatggctatctctctggaaaacaaa(BamHI)为上游引物，以rdh
‑
R：gtttctttaccagactcgagttacagatcaacgctgttcgg(HindIII)为下游引物进行PCR扩增，扩增得到目的片段rdh；用限制性内切酶BamHI和HindIII对质粒pRSFDuet
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1在37℃进行双酶切，再用无缝克隆试剂盒对基因片段和质粒pRSFDuet
‑
1进行重组连接，得到重组质粒pRSFDuet
‑
rdh。以来源于枯草本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种高效制备D
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阿洛酮糖和葡萄糖酸的方法，其特征在于，以D
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葡萄糖为原料，加入重组大肠杆菌A湿菌体，进行全细胞催化反应后，反应完成后灭菌，灭菌离心获得葡萄糖酸；上清液加入重组大肠杆菌B进行催化反应，制得D
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阿洛酮糖；所述重组大肠杆菌A湿菌体同时表达Bacillus sp.的葡萄糖异构酶gi基因、Clostridium bolteae ATCCBAA
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613的D
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阿洛酮糖
‑3‑
差向异构酶dpe基因、Providencia alcalifaciens的rdh基因、枯草WB800的葡萄糖脱氢酶GDH基因以及过表达大肠杆菌中的NAPRTase和NAD+Syn的编码基因pncB和nadE；所述重组大肠杆菌B同时表达Rubrivivax sp.的糖醇脱氢酶SDH基因、Streptococcus pyogenes的NADH氧化酶NOX基因。2.根据权利要求1所述的制备葡萄糖糖酸和D
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阿洛酮糖的方法，其特征在于，所述重组大肠杆菌A按以下方法构建：将来源于Bacillus sp.的葡萄糖异构酶基因gi以及来源于Clostridium bolteae ATCCBAA
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613的D
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阿洛酮糖
‑3‑
差向异构酶基因dpe连接在pRSFDuet
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1上，得到重组质粒pRSFDuet
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gi
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dpe；将来源于Providencia alcalifaciens的rdh基因片段以及来源于枯草WB800的GDH基因片段其连接在pETDuet
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1表达载体得到质粒pETDuet
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gdh
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rdh；再将重组质粒pRSFDuet
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gi
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dpe和重组质粒pETDuet
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gdh
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r...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘继栋，王志琦，吕菁，冯婷婷，赵婧邑，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：