一种利用L-阿拉伯糖异构酶催化核苷制备D-核糖-1-磷酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用L

【技术实现步骤摘要】
一种利用L
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阿拉伯糖异构酶催化核苷制备D
‑
核糖
‑1‑
磷酸的方法


[0001]本专利技术属于D
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核糖
‑1‑
磷酸的生物催化合成方法
，具体涉及一种利用L
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阿拉伯糖异构酶催化核苷制备D
‑
核糖
‑1‑
磷酸的方法。

技术介绍

[0002]疫苗、抗体、尤其是小分子药物等成为研发热点，其中核苷类药物包括Remdesivir、Molnupiravir与Azvudine等因其良好的抗病毒活性而备受关注。核苷类药物与天然核苷具有相似结构，在体内能够直接作用或干扰核酸的合成，因此具有良好的抗肿瘤、抗病毒和抗菌活性。核苷类药物是目前临床上用量最大、品种最多的小分子抗病毒药物，2021 年我国核苷类药物行业市场规模约732亿元，因此其合成方法、工艺以及原料也受到工业界广泛关注。
[0003]D
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核糖
‑1‑
磷酸在体内可进入糖酵解途径作为能量来源，也能够通过磷酸化酶的作用转化为D
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核糖
‑5‑
磷酸和磷酸核糖焦磷酸。在工业上，D
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核糖
‑1‑
磷酸是酶法合成核苷类药物的重要中间体，在医药领域具有重要的应用价值。但D
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核糖
‑1‑
磷酸具有不稳定性，且目前暂无成熟的合成工艺出现，因此D
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核糖
‑1‑
>磷酸有巨大的市场空缺，产量供不应求。目前市场上所售的D
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核糖
‑1‑
磷酸通常以双环己铵盐的形式存在，且价格昂贵。
[0004]D
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核糖
‑1‑
磷酸的合成方式主要分为化学法和生物法，利用化学法合成D
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核糖
‑1‑
磷酸具有立体选择性差、产率低且对环境造成污染等问题；而生物法合成D
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核糖
‑1‑
磷酸具有生产成本低、污染小、反应条件温和等特点，同时还能够解决产物构型单一的问题，因此在工业应用上具有广阔的前景。目前D
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核糖
‑1‑
磷酸的生物法合成主要是利用核苷磷酸化酶催化核苷获得，但核苷磷酸化酶作为初级代谢产物，在细胞内大量表达会导致微生物遗传代谢系统发生紊乱，在一定程度上限制了其工业化应用。

技术实现思路

[0005]为了解决生物法合成D
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核糖
‑1‑
磷酸生产工艺缺乏的问题，本专利技术提供了一种成本低廉且能够实现高效转化的利用L
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阿拉伯糖异构酶催化核苷制备D
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核糖
‑1‑
磷酸的方法，研究发现L
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阿拉伯糖异构酶(L
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arabinose isomerase，L
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AI)具有多种催化功能性，除已经报道的能够催化L
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阿拉伯糖转化为L
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核酮糖外，还能够催化核苷生成D
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核糖
‑1‑ꢀ
磷酸与碱基，且该L
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阿拉伯糖异构酶的大量表达对宿主菌的生长无较大影响。
[0006]本专利技术为解决上述技术问题采用如下技术方案，一种利用L
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阿拉伯糖异构酶催化核苷制备D
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核糖
‑1‑
磷酸的方法，其特征在于：所述L
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阿拉伯糖异构酶的国际系统分类编号为EC5.3.1.4。
[0007]进一步限定，所述L
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阿拉伯糖异构酶的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1
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8所示。
[0008]进一步限定，所述核苷为胞苷、肌苷、腺苷、尿苷、鸟苷或胸苷中的一种或多种。
[0009]进一步限定，所述D
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核糖
‑1‑
磷酸的制备过程在纯酶反应体系、粗酶反应体系或静息细胞反应体系中进行，在以上反应体系中核苷的浓度1
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500mM，L
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阿拉伯糖异构酶的浓度为2
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7000μg/mL，反应体系的pH为3.5
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10.5，反应温度为20
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75℃。
[0010]进一步限定，所述核苷、L
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阿拉伯糖异构酶和缓冲液构成纯酶反应体系、粗酶反应体系或静息细胞反应体系，该缓冲液为HEPES缓冲液、磷酸缓冲液、MES缓冲液或 Tris
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HCl缓冲液中的一种或多种。
[0011]进一步限定，所述利用L
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阿拉伯糖异构酶催化核苷制备D
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核糖
‑1‑
磷酸的方法，其特征在于具体步骤为：将核苷溶解于1mL浓度为50mM，pH 9.0的Tris
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HCl缓冲液中至核苷的浓度为3mM，再加入L
‑
阿拉伯糖异构酶至其终浓度为5μg/mL，混匀，于37 ℃反应12h，取100μL反应液，加入900μL体积比为4:4:1的乙腈、甲醇和水的混合液终止反应，核苷的转化率最高达到72.3％。
[0012]本专利技术与现有技术相比具有以下优点和有益效果：本专利技术通过构建大肠杆菌工程菌来高效表达L
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阿拉伯糖异构酶，该L
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阿拉伯糖异构酶可催化核苷反应生成D
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核糖
‑1‑ꢀ
磷酸，且在大肠杆菌中大量表达该L
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阿拉伯糖异构酶对宿主菌生长无明显影响。因此，本专利技术将对D
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核糖
‑1‑
磷酸的生物合成产业将起到重大的推动作用。
具体实施方式
[0013]以下通过实施例对本专利技术的上述内容做进一步详细说明，但不应该将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本专利技术上述内容实现的技术均属于本专利技术的范围。
[0014]对比例1
[0015]酶失活条件下L
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AI的催化反应
[0016]将L
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AI在100℃水浴中加热30min，使L
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AI失活后备用。将腺苷溶解于1mL浓度为50mM，pH 7.0的磷酸盐缓冲液中至腺苷浓度为1mM，再加入失活的L
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AI至其终浓度为50μg/mL，混匀，于37℃反应2h，取100μL反应液，加入900μL体积比为 4:4:1的乙腈、甲醇和水的混合液终止反应。
[0017]利用高效液相色谱的紫外检测器和示差检测器分别检测反应液中腺苷与D
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核糖
‑1‑ꢀ
磷酸的浓度，在2h取样，仅检测到腺苷的特征峰。说明没有活性的L
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AI不能催化腺苷反应生成D
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用L
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阿拉伯糖异构酶催化核苷制备D
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核糖
‑1‑
磷酸的方法，其特征在于：所述L
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阿拉伯糖异构酶的国际系统分类编号为EC5.3.1.4。2.根据权利要求1所述利用L
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阿拉伯糖异构酶催化核苷制备D
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核糖
‑1‑
磷酸的方法，其特征在于：所述L
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阿拉伯糖异构酶的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1
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8所示。3.根据权利要求1所述的利用L
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阿拉伯糖异构酶催化核苷制备D
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核糖
‑1‑
磷酸的方法，其特征在于：所述核苷为胞苷、肌苷、腺苷、尿苷、鸟苷或胸苷中的一种或多种。4.根据权利要求1所述的利用L
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阿拉伯糖异构酶催化核苷制备D
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核糖
‑1‑
磷酸的方法，其特征在于：所述D
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核糖
‑1‑
磷酸的制备过程在纯酶反应体系、粗酶反应体系或静息细胞反应体系中进行，在以上反应体系中核苷的浓度1
‑
500 mM，L...

【专利技术属性】
技术研发人员：王海磊，李卓娅，刘玉雪，贾培，余国营，
申请(专利权)人：河南师范大学，
类型：发明
国别省市：