一种基于限域效应实现重组大肠杆菌控温发酵高效合成D-阿洛酮糖的方法技术

本发明专利技术提供了一种基于限域效应实现重组大肠杆菌控温发酵高效合成D

【技术实现步骤摘要】
一种基于限域效应实现重组大肠杆菌控温发酵高效合成D
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阿洛酮糖的方法


[0001]本专利技术属于生物化工领域，具体涉及利用驯化培养大肠杆菌的方法通过转录组分析得到上调的膜蛋白基因，随后利用基因工程技术改造大肠杆菌，得到空间限域的重组菌株，通过温控设计能够很大程度提高D
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果糖合成D
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阿洛酮糖的转化率。

技术介绍

[0002]D
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阿洛酮糖 (D
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Allulose) 作为D
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果糖的C
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3差向异构体，是自然界中天然存在的稀有单糖，并且具有极低卡路里和较高甜度，同时有着特殊的理化性质与生理功能，例如抗炎、抗氧化、降血糖；所以D
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阿洛酮糖不仅是一种理想的代糖产品，且在保健品行业具有较大市场潜力，故D
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阿洛酮糖的合成一直备受关注。
[0003]现阶段生物酶催化法和微生物发酵法在D
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阿洛酮糖的合成方法中条件最为温和，能耗较低且对环境无毒，故生物法合成D
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阿洛酮糖备受关注。生物酶催化法合成D
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阿洛酮糖的弊端在于生物酶的成本较高，稳定性较差且固定化较为繁琐，相较之下，微生物发酵法不仅规避了酶不稳定且成本较高的问题，同时具备生物法合成D
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阿洛酮糖的优势：原料绿色、过程绿色和产品绿色。目前有两种微生物发酵合成D
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阿洛酮糖的方法：可逆异构化反应和磷酸化、脱磷酸化不可逆反应。可逆异构化反应转化率偏低，产率较高，磷酸化和脱磷酸化反应属于不可逆反应，转化率和产率较低。可逆异构化反应可以基于空间限域效应，通过基因工程技术构建重组大肠杆菌稳定产出D
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阿洛酮糖，提高其转化率，使其高效合成D
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阿洛酮糖。

技术实现思路

[0004]本专利技术旨在针对上述问题，提供一种基于限域效应实现重组大肠杆菌控温发酵高效合成D
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阿洛酮糖的方法。通过敲除大肠杆菌JM109 (DE3)的基因galE并引入外源基因rpi，将重组大肠杆菌在以D
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阿洛酮糖为碳源的LB培养基中进行驯化培养，对该菌株进行转录组测序分析，确定大肠杆菌中D
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阿洛酮糖的内转运蛋白关键基因fryA，基于限域效应，将fruA, mak, manXYZ, galE连同fryA敲除后，表达dpe和ptsG
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F，通过温度的选择与调控，提高D
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果糖合成D
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阿洛酮糖的产量。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术的实施方案如下：一种基于限域效应实现重组大肠杆菌控温发酵高效合成D
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阿洛酮糖的方法：首先以大肠杆菌JM109 (DE3)为宿主，敲除UDP
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葡萄糖
‑4‑
差向异构酶基因galE，并引入核糖
‑5‑
磷酸异构酶基因rpi，构建重组菌株JM109 (DE3) (RPI, ΔGalE)，使用含D
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阿洛酮糖的LB培养基对重组菌株JM109 (DE3) (RPI, ΔGalE)进行驯化培养，以提高重组菌株中D
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阿洛酮糖内转运蛋白的表达量，之后进行转录组测序分析，筛选出大肠杆菌的D
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阿洛酮糖内转运蛋白关键基因fryA；随后在大肠杆菌JM109 (DE3)中敲除果糖特异性PTS多磷酸化转运蛋白基因fruA，果糖激酶基因mak，甘露糖特异性PTS转运蛋白基因manXYZ， UDP
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葡萄糖
‑4‑
差
向异构酶基因galE，以及D
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阿洛酮糖内转运蛋白关键基因fryA，共5个基因，并引入D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶基因dpe和果糖非特异性转运蛋白基因ptsG
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F，构建重组菌株JM109 (DE3) (DPE, PtsG
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F, ΔFruA, ΔMak, ΔManXYZ, ΔGalE，ΔFryA)，该重组菌株通过控温发酵，最终实现D
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阿洛酮糖的高效合成。
[0006]一种基于限域效应实现重组大肠杆菌控温发酵高效合成D
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阿洛酮糖的方法，具体包括以下步骤：（1）在野生型大肠杆菌JM109 (DE3)中敲除UDP
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葡萄糖
‑4‑
差向异构酶基因galE，并引入核糖
‑5‑
磷酸异构酶基因rpi，构建重组菌株JM109 (DE3) (RPI, ΔGalE)；通过在LB培养基中添加D
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阿洛酮糖对重组菌株JM109 (DE3) (RPI,ΔGalE)进行驯化培养，后经转录组测序分析，筛选出D
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阿洛酮糖的内转运蛋白关键基因fryA。
[0007]（2） 在野生型大肠杆菌JM109 (DE3)中敲除果糖特异性PTS多磷酸化转运蛋白基因fruA, 果糖激酶基因mak, 甘露糖特异性PTS转运蛋白基因manXYZ和UDP
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葡萄糖
‑4‑
差向异构酶基因galE，D
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阿洛酮糖的内转运蛋白关键基因fryA，同时引入外源基因D
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阿洛酮糖3
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差向异构酶基因dpe，以及过表达第34位碱基g突变为t的大肠杆菌基因ptsG，即ptsG
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F，得到重组菌株JM109 (DE3) (DPE, PtsG
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F, ΔFruA, ΔMak, ΔManXYZ, ΔGalE，ΔFryA)。
[0008]（3）在步骤（2）得到的重组菌株JM109 (DE3) (DPE, PtsG
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F, ΔFruA, ΔMak, ΔManXYZ, ΔGalE, ΔFryA)的基础上，根据外源基因dpe的体外酶催化实验，确定D
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果糖合成D
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阿洛酮糖转化率最高的温度，同时结合大肠杆菌耐热性实验，获得重组大肠杆菌JM109 (DE3) (DPE, PtsG
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F, ΔFruA, ΔMak, ΔManXYZ, ΔGalE，ΔFryA)由高温状态49 ℃切换为低温状态30 ℃，细胞正常生长。
[0009]（4）重组大肠杆菌JM109 (DE3) (DPE, PtsG
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F, ΔFruA, ΔMak, ΔManXYZ, ΔGalE, ΔFryA)通过摇瓶温控实验，确定了发酵罐补料分批发酵的方式，发酵产物利用高效液相色谱进行分析。
[0010]进一步，上述步骤（1）中驯化培养重组菌株JM109 (DE3) (RPI, ΔGalE)的条件是：重组大肠杆菌在含有终浓度4 g/L D
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阿洛酮糖的100mL LB培养基中，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
(DE3)敲除的基因fruA, mak和galE的NCBI序列号分别为NP_416672.1, NP_414928.2和NP_415280.3，ManXYZ是三个基因的组合，NCBI序列号分别为 NP_416331.1, NP_416332.1和NP_416333.4；大肠杆菌中表达的外源基因dpe来自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)C58，NCBI序列号为WP_010974125.1，基因ptsG
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F来源于大肠杆菌K
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12菌株，其第34位碱基g突变为t，从而缬氨酸突变为苯丙氨酸，基因序列参考NCBI数据库，序列号为NP_415619.1。6.根据权利要求2所述的基于限域效应实现重组大肠杆菌控温发酵高效合成D
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阿洛酮糖的方法，其特征在于，步骤（3）所述的通过高、低温切换，提高重组菌株JM109 (DE3) (DPE, PtsG
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F, ΔFruA, ΔMak, ΔManXYZ, ΔGalE，ΔFryA)合成D
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阿洛酮糖的转化率；体外酶催化实验体系为500 μL，所用缓冲液为pH 7.0，50 mM Tris
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HCl ，D
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果糖浓度...

【专利技术属性】
技术研发人员：范立海，张亚星，郭强，郑灵洁，郑辉东，
申请(专利权)人：清源创新实验室，
类型：发明
国别省市：