连续生产赤藓酮糖的工艺方法技术

本发明专利技术公开了一种基于赤藓糖醇与日本葡萄糖酸杆菌发酵体系的连续化与固定化相结合的L

【技术实现步骤摘要】
连续生产赤藓酮糖的工艺方法


[0001]本专利技术涉及生物转化和微生物发酵领域，具体地说涉及一种连续生产L
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赤藓酮糖的工艺方法。

技术介绍

[0002]L
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赤藓酮糖(L
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erythrulose,DHB)常温下为淡黄色液体，高纯度(78～85％)的L
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赤藓酮糖是黄色粘稠状液体，有甜味，其在自然界存在，但含量极少，属于稀有糖。
[0003]L
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赤藓酮糖具有生物可降解性，能够食用且没有毒性，其含有酮基，理化性质活跃，能够参与并催化许多反应，因此是化工合成中重要的中间体和多性能添加剂，在食品、化工领域和制药领域应用广泛。
[0004]L
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赤藓酮糖的生产目前主要以赤藓糖醇为原料，经化学法或生物发酵法获得。以赤藓糖醇为前体的化学合成法，此法比较繁琐，且产物为消旋体手性化合物，拆分困难，不利于纯化。微生物法包括了以赤藓糖醇为底物的微生物发酵法以及静息细胞转化法，其通过发酵过程中的酶促反应，可选择性生成L型产物，且该法具有操作简便，反应条件温和、过程易于控制、原料利用率及产品纯度高、绿色环保等优点。
[0005]L
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赤藓酮糖生物催化生产的最大的难点在于L
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赤藓酮糖难实现结晶，目前市面上主要的产品为浓度大于85％的浓缩液，如何提高L
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赤藓酮糖浓缩液的纯度是产业化生产中面临的最大难点，而发酵产物中包含底物赤藓糖醇、菌体蛋白等杂质，过度催化可以降低底物赤藓糖醇浓度，但随之带来的菌体自融破碎会给发酵产物增加菌体蛋白、核酸等杂质；而单纯生物催化连续生产又无法实现底物的充分利用。会导致产物的纯度不佳，同时影响其L
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赤藓酮糖的收率，使提纯成本增加。
[0006]中国专利CN201410112899.6(公开日2014年07月30日)公开了一种能微生物发酵生产L
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赤藓酮糖的菌株HD385。其可利用常规氮源(如牛肉膏、玉米浆、尿素等)和赤藓糖醇等原料生物发酵制备L
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赤藓酮糖，经发酵培养获得186.5g/L的L
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赤藓酮糖。该工艺的反应体系中含有较多的磷酸钾、碳酸钙，不利于L
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赤藓酮糖的纯化，且重复利用率低。

技术实现思路

[0007]在进行L
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赤藓酮糖的发酵生产时，我们发现底物赤藓糖醇和产物L
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赤藓酮糖的浓度对菌体生长有影响，二者浓度过高时都会抑制菌体活力，同时底物的浓度高低会影响后期L
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赤藓酮糖提纯时的纯度。而L
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赤藓酮糖的纯度高低会直接影响其价格，纯度越高的产品价格也越高，L
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赤藓酮糖提纯工艺一直都是一个研究热点和难点。针对L
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赤藓酮糖提纯难度的技术问题，本申请提出一种连续灌流催化和连续固定化细胞催化相偶联的生产方法。
[0008]本该方法可实现连续化生物催化和连续化固定化细胞，其可以提高产率，降低产物底物浓度，提高产品纯度。本专利技术旨在解决现有工艺反应体系复杂、产品纯化困难、生产耗损多等问题。生产L
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赤藓酮糖时，我们利用中空纤维过滤系统将L
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赤藓酮糖从发酵液中
分离出来，从而降低L
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赤藓酮糖对菌体的抑制作用，同时严格控制底物赤藓糖醇的浓度。然后利用固定化菌体消耗分离出来的L
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赤藓酮糖液体中残余的赤藓糖醇，从而降低了其提纯的难度，提高了产品L
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赤藓酮糖的纯度。同时对于发酵后期菌体活力的衰减，我们构建了相应的菌体复苏体系，进行了多次的优化和改进后，确定了最终的体系。该体系和中空纤维过滤系统的联合使用，可以实现连续生产L
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赤藓酮糖的目的，同时可以最大限度地降低后续提纯的难度，减少多余的生产耗损，以更低的成本投入去获得更高的收益回报。
[0009]本专利技术连续化将赤藓糖醇流加入含有日本葡萄糖酸杆菌培养物的生物反应器中，并通过与该生物反应器连接的中空纤维过滤系统连续性收获过滤后的发酵产物赤藓酮糖；与该生物反应器连接的固定化细胞模块，在线实现排出培养物(日本葡萄糖酸杆菌)的重复有效利用，降低传统连续生产过程Bleeding细胞的浪费和处理难度，并通过固定化细胞与连续收获发酵产物的催化反应，大大降低了发酵产物赤藓酮糖中赤藓糖醇的残留量，提高了产物的浓度，大大降低了游纯化结晶的难度。
[0010]本专利技术的方法包括如下步骤：
[0011]S1、以含有赤藓糖醇、酵母膏的第一反应体系进行日本葡萄糖酸杆菌发酵，当第一反应体系中浓度为L
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赤藓酮糖高于140g/L，同时赤藓糖醇低于5g/L时，开始向第一体系中流加赤藓糖醇，同时打开同步分离装置，利用中空纤维过滤系统循环分离发酵液，得到包含L
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赤藓酮糖的滤出液；
[0012]S2循环一段时间后(通常为18
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36h，如循环24小时后)，停止循环与赤藓糖醇补料，取出适量发酵液，再补充等量的新鲜培养基，重新开始发酵，当赤藓糖醇低于5g/L时，再次开始流加赤藓糖醇同时打开同步分离装置，利用中空纤维过滤系统循环分离发酵液，继续生产L
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赤藓酮糖；
[0013]优选的，取出发酵液时，可以取出5
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20％的发酵液，比如10％的发酵液，对取出的发酵液进行检测；取出适量发酵液再补充等量的新鲜培养基可以向系统中补充充足的营养，以便细菌生长与繁殖，从而复苏菌体活力，重新开始发酵；
[0014]S3、将S2取出的发酵液离心，得到菌体和L
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赤藓酮糖清液；
[0015]对菌体进行固定化处理，然后将固定化菌体加入中空纤维过滤系统所过滤出的L
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赤藓酮糖滤出液中消耗其中残余的赤藓糖醇，30℃下培养，维持pH在5.8
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6.2之间，通气量不高于1.2vvm，同时转速尽量维持在100rpm/min以下，反应结束后将L
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赤藓酮糖清液分离出来，再次加入新的过滤液继续反应；
[0016]优选的，菌体进行固定化处理的方法为：
[0017]步骤1：按照重量比配制海藻酸钠溶液，其中海藻酸钠质量分数为3％
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4％，卡拉胶质量分数为0.36％
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0.4％，将菌体与海藻酸钠溶液按照重量比1:20混合，得到海藻酸钠复合材料溶液；
[0018]步骤2：按照重量比配制氯化钙溶液，其中氯化钙质量分数为4％
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5％，氯化钾质量分数为0.5％
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0.6％；
[0019]步骤3：将海藻酸钠复合材料溶液以5d/s的速度滴入氯化钙溶液中，于4℃浸泡0.5h
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1h，再用PBS溶液清洗三遍，滤干备用。
[0020]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.连续生产赤藓酮糖的工艺方法，其特征在于，连续化将赤藓糖醇流加入含有日本葡萄糖酸杆菌培养物的生物反应器中，并通过与该生物反应器连接的中空纤维过滤系统连续性收获过滤后的发酵产物赤藓酮糖，该生物反应器连接有固定化细胞模块，在线实现排出日本葡萄糖酸杆菌的重复有效利用，具体包括以下步骤：S1、以含有赤藓糖醇的第一反应体系进行日本葡萄糖酸杆菌发酵，反应一段时间后，向第一反应体系中流加赤藓糖醇，并采用中空纤维过滤系统循环分离发酵液，得到包含L
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赤藓酮糖的滤出液；S2、中空纤维过滤系统开启一段时间后，停止流加赤藓糖醇并关闭中空纤维过滤系统，取出适量发酵液，同时补充等量的新鲜培养基，重新开始发酵，当赤藓糖醇低于5g/L时，再次开始流加赤藓糖醇继续生产L
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赤藓酮糖，同时打开中空纤维过滤系统循环分离发酵液，得到包含L
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赤藓酮糖的滤出液，S3、将S2取出的发酵液离心，得到菌体和L
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赤藓酮糖清液；对菌体进行固定化处理，然后将固定化菌体加入中空纤维过滤系统所过滤出的L
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赤藓酮糖滤出液中消耗其中残余的赤藓糖醇，30℃下培养，维持pH在5.8
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6.2之间，通气量不高于1.2vvm，同时转速尽量维持在100rpm/min以下，反应结束后将L
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赤藓酮糖清液分离出来，再次加入新的L
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赤藓酮糖滤出液继续反应；将L
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赤藓酮糖清液应在45～55℃下浓缩，活性炭脱色，得赤藓酮糖；S4、重复S2
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S3，直至L
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赤藓酮糖生产效率大幅度下降。2.如权利要求1所述的连续生产赤藓酮糖的工艺方法，其特征在于，S1中当第一反应体系中L
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赤藓酮糖高于140g/L，同时赤藓糖醇低于5g/L时，开始向第一反应体系中流加赤藓糖醇。3.如权利要求1所述的连续生产赤藓酮糖的工艺方法，其特征在于，第一反应体系包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙杨，刘唐，刘宇鹏，李华，许银彪，李文杰，关一鸣，
申请(专利权)人：河南大学，
类型：发明
国别省市：