一种不透明红球菌L-氨基酸氧化酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种不透明红球菌L

【技术实现步骤摘要】
一种不透明红球菌L
‑
氨基酸氧化酶突变体及其应用


[0001]本专利技术涉及一种不透明红球菌L
‑
氨基酸氧化酶突变体及其应用，属于生物工程


技术介绍

[0002]α
‑
酮酸是羧基在α碳原子上的酮酸。羧基和酮基两种官能团使得酮酸分子既具有羧酸的成盐、成酯性质，又具有酮的羟胺反应和加氢还原反应等。在生物体内，α
‑
酮酸是氨基酸代谢中的重要物质。基于其特殊的化学和生物学性质，α
‑
酮酸在医药、食品、饲料、化妆品领域被广泛应用，尤其是在有机化合物药物合成以及生物合成领域中作为重要的合成中间体。
[0003]目前，可用于工业生产α
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酮酸的方法主要包括化学法和生物转化法。其中生物转化法在生产安全、经济效益和环境保护等方面均优于化学合成法，是工业化生产α
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酮酸的优选方法。酶转化法是生物转化法的一种，是利用L
‑
氨基酸氧化酶(LAAO，L
‑
amino acid oxidase，EC1.4.3.2)对底物L
‑
氨基酸进行转化获得α
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酮酸。L
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氨基酸的氧化脱氨反应可以分为两个步骤：首先将氨基酸Cα上的氢转移给FAD，氨基酸变成亚氨基酸，亚氨基酸不稳定分解成α
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酮酸和水。然后FADH2被氧分子氧化后，变成了还原型FAD。由于酶转化法中用到的底物L
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氨基酸成本低并且转化周期较短等优点使其具备很大的工业应用价值。但是，目前运用酶转化法大规模制备α
‑
酮酸有以下缺陷：(1)LAAO底物谱广窄不一，需要对不同类型的LAAO进行底物谱测定；(2)底物谱较广的LAAO可能催化效率较低；(3)LAAO催化合成α
‑
酮酸时伴随着H2O2的生成。因此迫切需要解决筛酶和LAAO的催化效率的问题，以实现酶转化法制备α
‑
酮酸实现规模化应用。
[0004]蛋白质工程是在分子水平改善酶的性质最有效的方法，如扩大底物范围、提高酶的活性和改善酶的稳定性。通过蛋白质工程设计RoLAAO，可能解决其催化效率低的问题。目前，利用蛋白质工程改造LAAO的技术已经取得了一定的研究进展，通过在多个不同的关键位点同时突变，综合提高LAAO对几种特定底物的催化效率。这种多突变体改造后的RoLAAO兼具较广的底物谱和远高于野生型的催化效率，以其催化转化低价值的L
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氨基酸生产更昂贵的α
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酮酸极具研究价值。但是，尚无发现一种既具有较广的底物谱又具有较高催化效率的LAAO酶，限制了α
‑
酮酸的规模化制备。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种可以高效制备α
‑
酮酸的RoLAAO突变体，并利用RoLAAO突变体蛋白催化L
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Leu、L
‑
Ile、L
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Met、L
‑
Val及L
‑
Phe制备五种α
‑
酮酸(4
‑
甲基
‑2‑
酮基戊酸(酮亮氨酸,α
‑
KIC)、3
‑
甲基
‑2‑
酮基戊酸(酮异亮氨酸,α
‑
KMV)、2
‑
酮基
‑4‑
甲硫基丁酸(酮蛋氨酸,α
‑
KMTB)、3
‑
甲基
‑2‑
酮基丁酸(酮缬氨酸,α
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KIV)及2
‑
酮基
‑
3苯基丙酸(苯丙酮酸,α
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PPA))。本专利技术还构建了表达RoLAAO突变体的重组菌株，该重组菌株在制备α
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酮酸时具有高生产强度，高催化稳定性，可减少投菌量，极大节约了工业化的生产成本。
[0006]本专利技术提供了一种不透明红球菌(Rhodococcus opacus)L
‑
氨基酸氧化酶RoLAAO突变体，所述不透明红球菌L
‑
氨基酸氧化酶RoLAAO的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述L
‑
氨基酸氧化酶RoLAAO的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。进一步的，L
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氨基酸氧化酶RoLAAO不仅仅局限于Rhodococcus opacus来源。
[0007]在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体相对于RoLAAO亲本，将第226位酪氨酸突变为组氨酸，获得突变体RoLAAO
Y226H
。
[0008]在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体相对于RoLAAO亲本，将第227位天冬氨酸突变为组氨酸，获得突变体RoLAAO
D227H
。
[0009]在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体相对于RoLAAO亲本，将第371位酪氨酸突变为亮氨酸，获得突变体RoLAAO
Y371L
。
[0010]在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体相对于RoLAAO亲本，将第466位丙氨酸突变为半胱氨酸，获得突变体RoLAAO
A466C
。
[0011]在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体相对于RoLAAO亲本，将第467位色氨酸突变为丙氨酸，获得突变体RoLAAO
W467A
。
[0012]在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体相对于RoLAAO亲本，将第226位酪氨酸突变为组氨酸，第227位天冬氨酸突变为组氨酸，获得突变体RoLAAO
Y226H/D227H
。
[0013]在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体相对于RoLAAO亲本，将第371位酪氨酸突变为亮氨酸，第466位丙氨酸突变为半胱氨酸，第467位色氨酸突变为丙氨酸，获得突变体RoLAAO
Y371L/A466C/W467A
。
[0014]在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体相对于RoLAAO亲本，将第226位酪氨酸突变为组氨酸，第227位天冬氨酸突变为组氨酸，第371位酪氨酸突变为亮氨酸，第466位丙氨酸突变为半胱氨酸，第467位色氨酸突变为丙氨酸，获得突变体RoLAAO
Y226H/D227H/Y371L/A466C/W467A
。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，所述突变体RoLAAO
Y226H
、RoLAAO
D227H
、RoLAAO
Y371L
、RoLAAO
A466C
、RoLAAO
W467A
、RoLAAO
Y226H/D227H
、RoLAAO
Y371L/A466C/W467A
、RoLAAO
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种不透明红球菌L
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氨基酸氧化酶RoLAAO突变体，其特征在于，所述L
‑
氨基酸氧化酶RoLAAO的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述突变位点包括L
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氨基酸氧化酶RoLAAO的第226位、第227位、第371位、第466位、第467位的氨基酸中的一个或多个。2.根据权利要求1所述的突变体，其特征在于，所述突变体为以下之一：(a)将SEQ ID NO.1所示氨基酸的第226位酪氨酸突变为组氨酸，获得突变体RoLAAO
Y226H
；(b)将SEQ ID NO.1所示氨基酸的第227位天冬氨酸突变为组氨酸，获得突变体RoLAAO
D227H
；(c)将SEQ ID NO.1所示氨基酸的第371位酪氨酸突变为亮氨酸，获得突变体RoLAAO
Y371L
；(d)将SEQ ID NO.1所示氨基酸的第466位丙氨酸突变为半胱氨酸，获得突变体RoLAAO
A466C
；(e)将SEQ ID NO.1所示氨基酸的第467位色氨酸突变为丙氨酸，获得突变体RoLAAO
W467A
；(f)将SEQ ID NO.1所示氨基酸的第226位酪氨酸突变为组氨酸，第227位天冬氨酸突变为组氨酸，获得突变体RoLAAO
Y226H/D227H
；(g)将SEQ ID NO.1所示氨基酸的第371位酪氨酸突变为亮氨酸，第466位丙氨酸突变为半胱氨酸，第467位色氨酸突变为丙氨酸，获得突变体RoLAAO
Y371L/A466C/W467A
；(h)将SEQ ID NO.1所示氨基酸的第226位酪氨酸突变为组氨酸，第227位天冬氨酸突变为组氨酸，第371位酪氨酸突变为亮氨酸，第466位丙氨酸突变为半胱氨酸，第467位色氨酸突变为丙氨酸，获得突变体RoLAAO
Y226H/...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴静，武耀运，何志震，陶金阳，李春旺，马腾飞，闫昕，苗登路，刘立明，宋伟，魏婉清，周怡雯，陈修来，刘佳，高聪，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：