一种突变型尿酸酶及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术及制药领域，具体涉及一种突变型尿酸酶及其应用。具体地，本发明专利技术公开了一种突变型尿酸酶，所述突变型尿酸酶是在野生型尿酸酶基础上进行定点氨基酸突变，并且在突变型尿酸酶中偶联PEG，定点突变后的尿酸酶经PEG修饰，降低了PEG用量，提高了修饰均一度和酶活，产品更稳定且均一，具有广泛的应用前景。前景。

【技术实现步骤摘要】
一种突变型尿酸酶及其应用


[0001]本专利技术属于生物技术及制药领域，具体涉及一种突变型尿酸酶及其应用。

技术介绍

[0002]痛风是一种由于嘌呤生物合成代谢增加，尿酸产生过多或因尿酸排泄不良而致血中尿酸升高，尿酸盐结晶沉积在关节滑膜、滑囊、软骨及其他组织中引起的反复发作性炎性疾病。它是由于单钠尿酸盐结晶(MSU)或尿酸在细胞外液形成超饱和状态，使其晶体在组织中沉积而造成的一组异源性疾病。随着我国生活水平的提高，饮食结构及生活方式的改变痛风病发病率正迅速增高，疼痛剧烈且反复发作，已成为困扰痛风患者的一大严重问题，痛风虽不直接危及患者性命，但是发病时的疼痛、对身体造成的损害、治疗所需费用都严重影响了患者的生活和工作，带给患者巨大的经济和精神负担。
[0003]目前临床使用的痛风常规治疗手段包括：镇痛消炎类药物和促进尿酸排泄的促尿酸排泄剂。然而，目前所有的常规疗法均无法治愈破坏性最强、患者痛苦最大的顽固性痛风石痛风。而且在长期服用上述药物以后，具有极大的副作用。活性尿酸酶可将溶解性低的尿酸盐转变为易溶的尿囊素，由肾脏更有效的排泄。在高尿酸血症和痛风的治疗方法中，利用不同的方法重组的尿酸酶能够快速有效降低患者血液中的尿酸，对于重度尿酸血症患者、难治性痛风患者以及肿瘤溶解综合征患者均具有较好的疗效。
[0004]由于尿酸酶的免疫原性比较大，并且在体内的半衰期短，所以为了降低免疫原性和延长半衰期，可以对其化学修饰。用PEG(聚乙二醇)对蛋白进行共价修饰，已证明可降低蛋白免疫原性、增加蛋白溶解度并延长蛋白的半衰期，往往蛋白结合的PEG越多，其体内的半衰期越长，而生物活性却降低得越多。目前，FDA已批准多种PEG修饰的重组蛋白药物上市。尿酸酶是一个同源四聚体，活性四聚体尿酸酶蛋白分子量高达140kDa，每个单体蛋白需偶联6个以上PEG方能有效降低其免疫原性。单体尿酸酶蛋白一般含有28
‑
32个赖氨酸残基，其中10
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12个赖氨酸残基位于蛋白三级结构表面可被PEG修饰，故尿酸酶PEG修饰研究中主要针对赖氨酸残基的ε氨基作为修饰位点进行修饰，而每次PEG修饰只能随机非定点的修饰其中一部分赖氨酸，这使得修饰产物十分不均一，产品批间一致性很难控制。

技术实现思路

[0005]为了解决现有技术中PEG饱和修饰尿酸氧化酶过程中均一度差、PEG使用量大的缺陷，本专利技术提供一种新的突变型尿酸酶(UOX)及其应用。
[0006]本专利技术的第一个方面提供一种突变型尿酸酶。所述突变型尿酸酶的具有氨基酸替换。在一个优选实施方案中，所述突变型尿酸酶在第47位、第65位、第73位、第185位、第265位和第284位具有一个或多个氨基酸替换；其中，所述的氨基酸位置基于SEQ ID NO.1所示的尿酸酶序列。
[0007]在一个优选实施方案中，所述突变型尿酸酶在第47位、第73位、第265位和第284位具有一个或多个氨基酸替换；其中，所述的氨基酸位置基于SEQ ID NO.1所示的尿酸酶序
列。
[0008]在一个优选实施方案中，所述氨基酸替换是由赖氨酸(Lys)替换为丙氨酸(Ala)。
[0009]在一个优选实施方案中，所述突变型尿酸酶具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。
[0010]本专利技术的第二个方面提供一种分离的多核苷酸，所述序列编码本专利技术第一方面所述的突变型尿酸酶。
[0011]在一个优选实施方案中，所述多核苷酸编码的突变型尿酸酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0012]在一个优选实施方案中，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0013]本专利技术的第三个方面提供一种载体，它含有本专利技术第二方面所述的多核苷酸。
[0014]本专利技术的第四个方面提供一种宿主细胞，它含有本专利技术第三方面所述的载体或在基因组中整合有本专利技术第二方面所述的多核苷酸。
[0015]本专利技术的第五个方面提供一种产生本专利技术第一方面所述突变型尿酸酶的方法，包括：在适合表达的条件下，培养本专利技术第四方面所述的宿主细胞，从而表达出本专利技术第一方面所述的突变型尿酸酶，分离所述突变型尿酸酶。
[0016]本专利技术的第六个方面提供了一种PEG化的突变型尿酸酶，所述的突变型尿酸酶为本专利技术第一方面所述的突变型尿酸酶。
[0017]本专利技术的第七个方面提供了一种制备PEG化突变型尿酸酶的方法，包括步骤：
[0018](1)提供一种突变型尿酸酶；
[0019](2)将突变型尿酸酶与PEG修饰剂混合、反应，从而得到PEG化的突变型尿酸酶。
[0020]本专利技术的第八个方面提供一种药物组合物，它含有有效量的本专利技术的PEG化的突变型尿酸酶，以及药学上可接受的载体。
[0021]本专利技术的优点：本专利技术的定点突变后的尿酸酶经PEG修饰，降低了PEG用量，提高了修饰均一度和酶活，产品更稳定且均一。
附图说明
[0022]图1：突变型尿酸酶发酵电泳图谱；泳道1：蛋白marker；泳道2：尿酸酶诱导前；泳道3：尿酸酶诱导后。
[0023]图2：突变型尿酸酶制备电泳图；泳道1：溶解液；泳道2：粗纯液；泳道3：精纯液；泳道4：中间体
[0024]图3：聚乙二醇修饰尿酸酶原液电泳图；泳道1：野生型PEG
‑
UOX蛋白；泳道2：突变型PEG
‑
UOX蛋白。
具体实施方式
[0025]下面结合具体实施例，对本专利技术做进一步阐述说明。应当理解为以下实施例仅用于说明本专利技术而非用于限制本专利技术的范围。本专利技术中所用的材料原料等无特殊说明均可通过商业途径获得。
[0026]实施例1重组质粒pET
‑
24a
‑
UOX的构建
[0027]1.1获取目的基因
[0028]尿酸酶突变体基因采用全序列合成的方式，将氨基酸序列SEQ ID NO.1所示的尿
酸酶基因中由密码子AAA编码的第47位、73位、265位和284位的赖氨酸(Lys)突变成由GCA编码的丙氨酸(Ala)，得到氨基酸序列SEQ ID NO.2所示的突变型尿酸酶的核苷酸序列(SEQ ID NO.3所示)，并在SEQ ID NO.3所示的突变型尿酸酶基因的5
′
端添加NdeⅠ和3
′
端添加BamHⅠ酶切位点，委托上海生工生物工程(上海)股份有限公司进行全基因合成测序，其合成的目的基因序列如SEQ IDNO.4所示。
[0029]1.2 DH5
ɑ
感受态细胞的制备
[0030]感受态细胞平板划线，37℃过夜培养。挑取单个菌落接种到5mL LB中，37℃摇床过夜培养12
‑
16h。取0.5mL过夜培养的菌液接种到50mL LB中100倍扩培，37℃恒温摇床培养2
‑
3h，期间用紫外分光光度计检测菌液浓度达到OD600 nm值为0.4或0.5时，立即转移到冰上预冷的5本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种突变型尿酸酶，其特征在于，所述突变型尿酸酶的第47位、第65位、第73位、第185位、第265位和第284位具有一个或多个氨基酸替换；优选的，所述突变型尿酸酶的第47位、第73位、第265位和第284位具有一个或多个氨基酸替换；其中，所述的氨基酸位置基于SEQ ID NO.1所示的尿酸酶序列。2.根据权利要求1所述的突变型尿酸酶，其特征在于，所述氨基酸替换是由赖氨酸替换为丙氨酸。3.根据权利要求1所述的突变型尿酸酶，其特征在于，所述突变型尿酸酶具有SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列。4.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述序列编码权利要求3所述的突变型尿酸酶。5.一种载体，其特征在于，它含有权利要求4所述的多核苷酸。6.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求5所述的载体或在基因组中整合有权利要求5所述的多核苷酸。7.一种产...

【专利技术属性】
技术研发人员：卞丽，郭新强，刘忠，
申请(专利权)人：山东新时代药业有限公司，
类型：发明
国别省市：