一种亚胺还原酶突变体及用途制造技术

本发明专利技术设计一种亚胺还原酶突变体在合成烟碱关键中间体（S）

【技术实现步骤摘要】
一种亚胺还原酶突变体及用途


[0001]本专利技术属于生物催化合成
，具体而言，涉及一种亚胺还原酶突变体在合成烟碱关键手性中间体(S)
‑3‑
(吡咯烷
‑2‑
基)吡啶中的应用。

技术介绍

[0002]烟碱（Nicotine）又称尼古丁，化学名为：1
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甲基
‑2‑
(3
‑
吡啶基)吡咯烷，是一种天然生成的液态生物碱，在烟草工业、精细化工、制药、有机合成、农业等有着重要的用途。尤其是高纯度烟碱，已成为国际市场上紧俏产品之一。(S)
‑3‑
(吡咯烷
‑2‑
基)吡啶作为烟碱合成中的关键手性中间体，目前已报道的制备工艺中最具优势的是利用亚胺还原酶催化3
‑
（1
‑
吡咯啉
‑2‑
基）吡啶进行制备，可以达到较高的光学纯度。
[0003]专利WO2020098978 A1公开了使用亚胺还原酶还原3
‑
（1
‑
吡咯啉
‑2‑
基）吡啶，具体公开了9种可用于还原3
‑
（1
‑
吡咯啉
‑2‑
基）吡啶的亚胺还原酶，以葡萄糖脱氢酶/葡萄糖为辅酶再生系统，进行(S)
‑
原烟碱的催化反应，这些亚胺还原酶包括：IRED
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A、IRED
‑
B、IRED
‑
C、IRED
‑/>D、 IRED
‑
E、 IRED
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F、IRED
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P、IRED
‑
X、IRED
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AB。IRED
‑
C在3
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（1
‑
吡咯啉
‑2‑
基）吡啶浓度为400 mmol/L（即58 g/L）时，24h转化率达99.6%，e.e值为99.8%；IRED
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C在3
‑
（1
‑
吡咯啉
‑2‑
基）吡啶浓度为1 mol/L（即146 g/L）时，24h转化率仅52.4%，e.e值为99.6%。其对3
‑
（1
‑
吡咯啉
‑2‑
基）吡啶的催化能力较差，不利于放大生产，生产成本也偏高。寻找不同生物来源的亚胺还原酶，并借助蛋白质工程方法对酶分子进行改造获得更加高效的亚胺还原酶，是实现烟碱关键手性中间体(S)
‑3‑
(吡咯烷
‑2‑
基)吡啶酶法工业化生产的努力方向。

技术实现思路

[0004]专利技术目的：针对现有生物法制备(S)
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(吡咯烷
‑2‑
基)吡啶的不足，提供一种适合工业化生产的制备工艺，为社会提供质优价廉的原料药。
[0005]技术方案：本专利技术基于Nocardiopsis alba菌株的天然亚胺还原酶而改进的亚胺还原酶及其编码基因，利用亚胺还原酶突变体催化前体3
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（1
‑
吡咯啉
‑2‑
基）吡啶合成(S)
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(吡咯烷
‑2‑
基)吡啶，反应式如下：式中：NAD是生物学专有名词，中文名：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，简称为辅酶；（P）表示括号内P可有可无，当有时，为NADP。
[0006]NADP是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate)的缩写，曾称为三磷酸吡啶核苷酸（TPN）或辅脱氢酶Ⅱ或氧化型辅酶Ⅱ。
[0007]本专利技术提供了一种改进的亚胺还原酶，即亚胺还原酶突变体，该亚胺还原酶突变
体的酶活性和立体选择性均高于野生型亚胺还原酶和专利WO2020098978 A1中的IRED
‑
C。
[0008]本专利技术的技术方案是，一种亚胺还原酶突变体，其氨基酸序列是SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列（对应编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO: 5）的突变体，可选的突变点位至少包括下列点位之一：第246位A或第285位D突变为V。
[0009]本专利技术所述亚胺还原酶突变体的氨基酸序列为：SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 4所示，对应编码基因的核苷酸序列分别为SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7或SEQ ID NO: 8所示。
[0010]根据本专利技术的另一方面，提供了一种重组质粒，重组质粒上含有上述任一种基因的核苷酸序列，进一步地，质粒为pET
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28a(+)、pET
‑
28b(+)、pET
‑
28c(+)、pET
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5b(+)、pET
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15b、pET
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24a(+)、pET
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24c(+)、pET
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24d(+)、pET
‑
25b(+)、pET
‑
27b(+)、pET
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28c(+)、pET
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29a(+)、pET
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29b(+)、pET
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29c(+)、pET
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30b(+)、pET
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30c(+)、pET
‑
30 Xa/LIC、pET
‑
30 EK/LIC、pET
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31b(+)、pET
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32b(+)、pET
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32c(+)、pET
‑
32 EK/LIC、pET
‑
32 Xa/LIC、pET
‑
33b(+)、pET
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37b(+)、pET
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39b(+)、pET
‑
40b(+)、pET
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41a(+)、pET
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41b(+)、pET
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42b(+)、pET
‑
42c(+)、pET
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43.1a(+)、pET
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43.1b(+)、pET
‑
43.1c(+)、pET
‑
43.1 EK/LIC、pET
‑
44a(+)、pET
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44b(+)、pET
‑
44c(+)、pET
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44 EK/LIC、pET
‑
45b(+)、pET
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46 EK/LIC、pET
‑
47b(+)、pET
‑
48b(+)、pET
‑
49b(+)、pET...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种亚胺还原酶突变体，其特征在于，所述亚胺还原酶突变体的氨基酸序列是在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列上发生突变的氨基酸序列，可选的突变点位包括下列点位：第285位D突变为V。2.一种重组质粒，其特征在于，含有权利要求1所述的亚胺还原酶突变体的编码基因。3.根据权利要求2所述的重组质粒，其特征在于，所述质粒为pET
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28a(+)、pET
‑
28b(+)、pET
‑
28c(+)、pET
‑
5b(+)、pET
‑
15b、pET
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24a(+)、pET
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24c(+)、pET
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24d(+)、pET
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25b(+)、pET
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27b(+)、pET
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28c(+)、pET
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29a(+)、pET
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29b(+)、pET
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29c(+)、pET
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30b(+)、pET
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30c(+)、pET
‑
30 Xa/LIC、pET
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30 EK/LIC、pET
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31b(+)、pET
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32b(+)、pET
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32c(+)、pET
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32 EK/LIC、pET
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32 Xa/LIC、pET
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33b(+)、pET
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37b(+)、pET
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39b(+)、pET
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40b(+)、pET
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41...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏俊刚，丛日刚，潘硕，杜永静，王恒峰，鞠传平，于大林，
申请(专利权)人：迪嘉药业集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：