L-丙氨酸脱氢酶突变体、工程菌及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种L

【技术实现步骤摘要】
stearothermophilus）。
[0009]本专利技术还涉及一种所述L
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丙氨酸脱氢酶突变体的编码基因。
[0010]本专利技术提供含有所述编码基因的工程菌。
[0011]本专利技术还提供一种所述L
‑
丙氨酸脱氢酶突变体在催化乙醛酸合成甘氨酸中的应用。
[0012]进一步，所述的应用方法为以含L
‑
丙氨酸脱氢酶突变体基因的工程菌经发酵离心收获的菌体细胞作为全细胞催化剂，以乙醛酸和铵根离子为底物，NADH为辅酶，葡萄糖脱氢酶催化葡萄糖再生辅酶NADH，氨水调节pH为7.0～8.0，温度20～45℃的条件下反应4～10h生产甘氨酸。
[0013]进一步，在转化体系中，催化剂的用量以湿菌体重量计为5～30g/L，底物乙醛酸浓度为5～20g/L。
[0014]进一步，含L
‑
丙氨酸脱氢酶突变体基因的工程菌按如下方法制备：将含L
‑
丙氨酸脱氢酶突变体基因的重组大肠杆菌接入LB斜面培养基于37℃培养箱培养12～16h；接菌种于LB液体种子培养基，37℃、200r/min振荡培养4～10h；以体积比1～10%接种量将种子液接入发酵培养基，置于发酵罐中培养，初始转速200 r/min，初始通气流量为1.0 L/min，随着菌体浓度增加调节转速与通气流量，以维持28
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32%的空气饱和度，用氨水调节pH值稳定在6.7～7.0，37℃培养6～10 h后加入乳糖至终浓度为2～10g/L并降温至20～30℃诱导表达；发酵过程中流加甘油溶液维持甘油浓度在1～3g/L，发酵结束后离心收集菌体，无菌生理盐水洗涤菌体两次，得L
‑
丙氨酸脱氢酶突变体全细胞催化剂。
[0015]进一步，所述的LB斜面培养基的制备方法：将酵母浸粉5 g/L、蛋白胨 10 g/L、NaCl 5 g/L、氨苄西林 100mg/L和琼脂 20 g/L混匀，调节pH7.0～7.2，121℃高压蒸汽灭菌20 min。
[0016]进一步，所述的LB液体种子培养基的制备方法：将酵母浸粉5 g/L、蛋白胨 10 g/L、NaCl 5 g/L和氨苄西林 100mg/L混匀，调节pH7.0～7.2，121℃高压蒸汽灭菌20 min。
[0017]进一步，所述的发酵培养基的制备方法：将甘油 15 g/L、丁二酸 5 g/L、蛋白胨 12 g/L、酵母浸粉5 g/L、MgSO
4 2 g/L、KH2PO
4 13 g/L、NH4Cl 3 g/L、豆粕水解液 2g/L、维生素B
1 50 μg/L和ZnSO
4 0.1mg/L混匀，调节pH6.8～7.2，121℃高压蒸汽灭菌20 min。
[0018]本专利技术与现有技术相比的有益效果：本专利技术构建的L
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丙氨酸脱氢酶突变体催化乙醛酸还原氨化反应的酶活力较原始提升明显，用于合成甘氨酸，产物浓度最高可达18.7g/L，转化率可达92.2%，具有工业化开发的应用前景。
具体实施方式
[0019]下面通过实施例来对本专利技术的技术方案做进一步解释，但本专利技术的保护范围不受实施例任何形式上的限制。
[0020]实施例1：表达载体和工程菌构建。通过文献报道和基因序列同源性，在NCBI数据库中查询并选择嗜热脂肪芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）的L
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丙氨酸脱氢酶（GenBank: WP_011232226.1），全基因合成L
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丙氨酸脱氢酶(基因序列为SEQ ID No .1，氨基酸序列为SEQ ID No .2)，设计引物，利用同源重组进行PCR扩增，亚克隆到载体pET32a的相应位点，获得重组质粒pET32a
‑
AlaDH。通过热激转化E. coli BL21(DE3)，得到表达L
‑
丙氨酸脱氢酶的重组大肠杆菌E. coli BL21(DE3)/ pET32a
‑ꢀ
AlaDH。
[0021]以重组载体pET32a
‑ꢀ
AlaDH作为模板，利用易错PCR技术构建随机突变文库。正向引物AlaDH
‑
F为5
’‑
acgacgacgacaaggccatggctatgaagatcggcattccaaaag
‑3’
，（acgacgacgacaaggccatggct为同源臂），反向引物AlaDH
‑
R为5
’‑
tcagtggtggtggtggtggtgctcgagtcatccctgcagcaacgaatg
‑3’ꢀ
（tcagtggtggtggtggtggtgctcgag为同源臂）。易错PCR的反应体系为：PCR Grade Water 39μL，10
×
TITANIUM Taq Buffer 5μL，MnSO
4 (8 mM) 1μL，dGTP (2 mM) 1μL，50
×
Diversify dNTP Mix 1μL，Primer mix 1μL，模板 1μL，TITANIUM Taq Polym 1μL，共50μL体系（其中反应体系中的Primer mix为所述上下游引物各0.5μL的混合溶液）。易错PCR反应条件为：94℃ 30s，1个循环；94℃ 30s，68℃ 1min30s，25个循环；68℃ 1min，1个循环。将易错PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶检测，并用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒进行纯化。纯化后的片段与双酶切的载体pET32a（Nco I和 Xho I）进行同源重组反应，反应体系为：4 μL 5
×
CE II Buffer，2μL Exase II，用ddH2O补齐20μL。混匀后37℃，融合30min，立即置于冰上冷却10min，然后转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态。并置于37℃，200r/min条件下培养1h进行活化，将活化后重组细胞涂布于含100mg/L氨苄西林抗性的LB平板上，37℃倒置培养过夜，获得L
‑
丙氨酸脱氢酶突变体表达文库。
[0022]从获得的L
‑
丙氨酸脱氢酶突变体表达文库菌落中利用高通量筛选方法，从这些单菌落中筛选高活性突变体菌株。其具体筛选方法为：从平板上随机挑取600个单菌落，接入96深孔板，培养基为LB液体培养基，37℃，200r/min培养9h后，离心收集菌体，去掉上清培养基后加入发酵培养基，37℃，220r/min培养6h后加入乳糖至终浓度为2.0g/L并降温至30℃诱导表达；离心收集菌体，测定酶活。标准酶活检测体系：10g/L湿菌体、50mM底物乙醛酸、葡萄糖 100mM，400U/mL 葡萄糖脱氢酶，反应介质为pH 8.0的磷酸盐缓冲液，总体系为1mL。单位酶活的定义：在标准的反应条件下，每分钟生成1μmol 甘氨酸所需要的酶量为一个酶活本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种L
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丙氨酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体是在SEQ ID NO：2所示氨基酸序列第129位、第299位发生多位点突变获得，具体为第129位亮氨酸突变为苯丙氨酸及第299位丙氨酸突变为丝氨酸，即L
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丙氨酸脱氢酶突变体AlaDH
ꢀ‑ꢀ
L129F
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A299S。2.根据权利要求1所述一种L
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丙氨酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述L
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丙氨酸脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。3.一种L
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丙氨酸脱氢酶突变体基因，其特征在于，所述基因编码权利要求1所述L
‑
丙氨酸脱氢酶突变体。4.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌含有权利要求3所述L
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丙氨酸脱氢酶突变体基因。5.一种L
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丙氨酸脱氢酶突变体的应用，其特征在于，所述应用为利用权利要求1所述L
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丙氨酸脱氢酶突变体催化乙醛酸合成甘氨酸。6.根据权利要求5所述L
‑
丙氨酸脱氢酶突变体的应用，其特征在于，以含L
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丙氨酸脱氢酶突变体基因的基因工程菌经发酵离心收获的菌体细胞作为全细胞催化剂，以乙醛酸和...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄清荣，冯志彬，陶美君，张娟，张兴晓，陈一展，
申请(专利权)人：鲁东大学，
类型：发明
国别省市：