环己胺氧化酶突变体及其在制备右美沙芬中间体中的应用制造技术

本发明专利技术属于生物制药和生物工程技术领域，具体为环己胺氧化酶突变体及其在制备右美沙芬合成中间体中的应用。本发明专利技术涉及环己胺氧化酶CHAO

【技术实现步骤摘要】
环己胺氧化酶突变体及其在制备右美沙芬中间体中的应用


[0001]本专利技术属于生物制药和生物工程
，具体涉及环己胺氧化酶CHAO
CCH12
‑
C2
突变体及其编码基因，并且涉及含有所述环己胺氧化酶突变体基因的工程菌的制备方法，以及该基因工程菌为生物催化剂，结合使用非选择性还原剂，动态动力学拆分消旋品胺制备(S)
‑1‑
(4
‑
甲氧基苄基)
‑
1，2，3，4，5，6，7，8
‑
八氢异喹啉((S)
‑
I)反应中的应用。

技术介绍

[0002](S)
‑1‑
(4
‑
甲氧基苄基)
‑
1，2，3，4，5，6，7，8
‑
八氢异喹啉是右美沙芬工业生产中的关键合成中间体。相较于化学方法，生物催化合成具有其自身的特点，包括优异的立体选择性、高分离产率、温和的反应条件和环境友好性等。朱敦明课题组使用来自氧化短杆菌IH
‑
35A的环己胺氧化酶CHAO
IH
‑
35A
的Y321I突变体以及来自马齿菌的亚胺还原酶，在半制备级规模下(0.5
‑
1mmol)不对称合成(S)
‑1‑
(4
‑
甲氧基苄基)
‑
1，2，3，4，5，6，7，8
‑
八氢异喹啉，均具有较高的立体选择性(>98％ee)(Scientific Report，2016，6，24973
‑
24981；Adv.Synth.Catal.，2019，361，556
‑
561]。然而，这些研究所报道的低底物浓度(10mM)限制了其实际工业应用潜力。我们前期通过基因挖掘及筛选获得一个新环己胺氧化酶CHAO
CCH12
‑
C2
(J.Org.Chem.，2020，85，5598
‑
5614.中国专利技术专利申请201910890595.5)。结合非选择性还原剂，该酶亦可实现对(S)
‑1‑
(4
‑
甲氧基苄基)
‑
1，2，3，4，5，6，7，8
‑
八氢异喹啉的动态动力学拆分合成。然而，酶活测定表明野生型CHAO
CCH12
‑
C2
对于底物(rac)
‑1‑
(4
‑
甲氧基苄基)
‑
1，2，3，4，5，6，7，8
‑
八氢异喹啉的酶活仅为0.083U/mg，远低于该酶对其天然底物环己胺的底物(2.16U/mg)。因此，提高该环己胺氧化酶对底物(rac)
‑1‑
(4
‑
甲氧基苄基)
‑
1，2，3，4，5，6，7，8
‑
八氢异喹啉的酶活对于实现其工业应用至关重要。
[0003]将基于结构的半理性设计与随机突变相结合，对来源于赤杆菌Erythrobacteraceae bacterium CCH12
‑
C2的环己胺氧化酶CHAO
CCH12
‑
C2
全酶进行分子改造，获得对rac
‑1‑
(4
‑
甲氧基苄基)
‑
1，2，3，4，5，6，7，8
‑
八氢异喹啉(rac
‑
I)氧化能力显著提升的突变体，并将其应用于高底物浓度rac
‑1‑
(4
‑
甲氧基苄基)
‑
1，2，3，4，5，6，7，8
‑
八氢异喹啉(rac
‑
I)的动态动力学拆分，此方法具有良好的工业应用价值。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是，针对野生型环己胺氧化酶CHAO
CCH12
‑
C2
动态动力学拆分反应中底物浓度低的问题，提供一种可有效提高催化活力的CHAO
CCH12
‑
C2
突变体蛋白质、编码该突变体蛋白质的核酸序列、含有该核酸序列的重组表达载体，以及含有所述环己胺氧化酶突变体基因的工程菌的制备方法，还提供其在动态动力学拆分rac
‑1‑
(4
‑
甲氧基苄基)
‑
1，2，3，4，5，6，7，8
‑
八氢异喹啉(rac
‑
I)，制备(S)
‑1‑
(4
‑
甲氧基苄基)
‑
1，2，3，4，5，6，7，8
‑
八氢异喹啉((S)
‑
I)中的应用。
[0005]本专利技术首先提供一种对rac
‑1‑
(4
‑
甲氧基苄基)
‑
1，2，3，4，5，6，7，8
‑
八氢异喹啉(rac
‑
I)氧化能力提高(即催化活力提高)的环己胺氧化酶CHAO
CCH12
‑
C2
突变体蛋白质。
Fly DNA polymerase，加无菌蒸馏水至50μL。
[0020]所述组合活性中心饱和突变PCR扩增程序为：(1)98℃变性3min；(2)98℃变性20s，(3)65℃退火30s，(4)72℃延伸8min，步骤(2)
‑
(4)共进行20个循环，最后72℃延伸10min，4℃保藏产物。
[0021]扩增得到的PCR产物经内切酶DpnI 37℃消化1小时后转化E.coli DH5,涂布于含卡那霉素(50μg/mL)的LB固体培养基，于37℃培养过夜，挑选阳性克隆子，接种于含卡那霉素(50μg/mL)的LB培养基，培养约8小时，提取质粒，测序，对突变文库质量进行评估。将质量合格的突变文库保藏于
‑
20℃，用于后续突变文库的筛选。
[0022]其中所述的易错PCR扩增为本领域常规技术，PCR反应的体系(50μL)为：模板50ng，5μL10
×
TaqBuffer，0.5μL dTTP(100mM)，0.5μL dCTP(100mM)，0.5μL dATP(20mM)，0.5μL dGTP(20mM)，一对突变引物各1μL(10μM)，0.5μLMgCl2(700mM)，0.375μLMnCl2(10mM)，2.5个单位的Taq DNA polymerase，加无菌蒸馏水至50μL。
[0023]所述易错PCR扩增程序为：(1)95℃变性3min；(2)94℃变性1min，(3)65℃退火30s，(4)72℃延伸2min，步骤(2)
‑
(4)共进行30个循环，最后72℃延伸10min，4℃保藏产本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种环己胺氧化酶突变体，其特征在于，是对如SEQ ID NO.2所示的野生型CHAO
CCH12
‑
C2
氨基酸序列的蛋白质进行如下突变得到：(a)同时或分别将第200位亮氨酸替换为缬氨酸，第201位异亮氨酸替换为亮氨酸，第209位缬氨酸替换为丝氨酸。2.根据权利要求1所述的环己胺氧化酶突变体，其特征在于，还包括：在(a)基础上、且保持酶催化活力的前提下，对如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质的第68位的组氨酸及第198位的谷氨酸分别或共同进行氨基酸残基替换，获得由CHAO
CCH12
‑
C2
衍生的具有环己胺氧化酶活性的突变体蛋白质。3.根据权利要求2所述的环己胺氧化酶突变体，其特征在于，为野生环己胺氧化酶CHAO
CCH12
‑
C2
的氨基酸残基发生如下任意一种情况的突变所获得的突变体：(1)野生环己胺氧化酶CHAO
CCH12
‑
C2
的氨基酸序列中，同时将第200位亮氨酸替换为缬氨酸，第201位异亮氨酸替换为亮氨酸，第209位缬氨酸替换为丝氨酸，命名为CHAO
CCH12
‑
C2L200V/I201L/V209S
；(2)野生环己胺氧化酶CHAO
CCH12
‑
C2
的氨基酸序列中，同时将第200位亮氨酸替换为缬氨酸，第201位异亮氨酸替换为亮氨酸，第209位缬氨酸替换为丝氨酸，且第68位组氨酸替换为谷氨酰胺，命名为CHAO
CCH12
‑
C2H68Q/L200V/I201L/V209S
；(3)野生环己胺氧化酶CHAO
CCH12
‑
C2
的氨基酸序列中，同时将第200位亮氨酸替换为缬氨酸，第201位异亮氨酸替换为亮氨酸，第209位缬氨酸替换为丝氨酸，且第68位组氨酸替换为谷氨酰胺，且第198位谷氨酸替换为甘氨酸，命名为CHAO
CCH12
‑
C2H68Q/E198G//L200V/I201L/V209S
。4.一种权利要求1
‑
3之一所述环己胺氧化酶突变体的获得方法，其特征在于，具体为：以含有来源于赤杆菌Erythrobacteraceae bacterium CCH12
‑
C2的野生环己胺氧化酶CHAO
CCH12
‑
C2
基因的重组载体pET28a
‑
CHAO
CCH12
‑
C2
为模板，利用含有组合活性中心饱和突变碱基信息的突变引物，通过PCR方法扩增，得到突变文库，转化后筛选得到突变体CHAO
CCH12
‑
C2L200V/I201L/V209S
；以含有突变体CHAO
CCH12
‑
C2L200V/I201L/V209S
基因的重组表达载体pET28a
‑
CHAO
CCH12
‑
C2L200V/I2...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈芬儿，黄则度，李祉宁，刘巾尧，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：