一种催化稀有人参皂苷生物合成的糖基转移酶及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术通过聚合酶链式反应克隆得到三七中糖基转移酶UGT33基因全长并成功在大肠杆菌中表达重组蛋白，首次鉴定确认该转移酶UGT33其可以催化人参皂苷上C20和C3位糖链的延伸的发生，能够分别催化人参皂苷CK，人参皂苷Rh2、人参皂苷F1和人参皂苷F2生成相应的加糖产物，具有极高的经济价值和应用前景。具有极高的经济价值和应用前景。具有极高的经济价值和应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种催化稀有人参皂苷生物合成的糖基转移酶及其编码基因与应用


[0001]本专利技术涉及基因工程领域，更为具体的，本专利技术涉及植物体外稀有人参皂苷的生物合成。

技术介绍

[0002]三七[Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen]，又名田七、山漆，为五加科(Araliceae)人参属多年生草本植物，是我国传统的名贵中药。三七主要以根和根茎入药，具有散瘀止血、消肿定痛之功效，应用历史悠久，收载于历年《药典》。三七中含有的皂苷类化合物为其主要的活性成分，包括以含量较高的人参皂苷Rb1、Rg1和三七皂苷R1为主的三七总皂苷对防治心脑血管疾病有显著作用。除含量较高的这些皂苷类化合物之外，三七中还含有较多稀有皂苷，由于其含量较少，因此限制了对稀有皂苷的研究和应用，并且三七植物生长年限较长、连作障碍现象严重等问题也大大限制了其应用。合成生物学应运而生，利用生物技术设计和改造微生物菌株来生产天然活性成分已经成为一种绿色可持续发展的新方法。
[0003]三七皂苷的主要成分为达玛烷型四环三萜类化合物。已有研究表明植物中达玛烷型四环三萜皂苷主要通过乙酸/甲羟戊酸途径合成，其生物合成途径包含了200多步连续的酶促反应，一般可划分为3个阶段：
①
合成异戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)；
②
由异戊烯基转移酶和萜类环化酶催化IPP和DMAPP形成2，3
‑
氧化鲨烯；
③
2，3
‑
氧化鲨烯依次经过环化、羟基化、糖基化修饰后最终形成三七皂苷。生物合成途径中含有的关键酶包括3
‑
羟基
‑3‑
甲基戊二酰辅酶A还原酶(3
‑
hydroxy
‑3‑
methylglutary
‑
coenzyme A reductase，HMGR)、法呢基焦磷酸合成酶(farnesyl pyrophaophate synthase，FPS)、鲨烯合成酶(squalene synthase，SS)、鲨烯氧化酶(squalene epoxidase，SE)、达玛烯二醇合成酶(dammarenediol synthase，DS)、细胞色素P450单加氧酶(cytochrome P450 monooxygenases，CYP450)和糖基转移酶(glycosyltransferase，GT)。
[0004]糖基转移酶可在植物体内催化单糖集团从活化的核苷酸供体与不同的受体结合，与受体分子的氧、氮、硫或碳原子形成糖苷键。三七中含有的糖基转移酶主要为以UDP
‑
戊糖、UDP
‑
己糖和UDP
‑
木糖为供体底物的UDP
‑
糖基转移酶(UGTs)。UGTs的C端附近有个由44个氨基酸组成的高度保守区，是植物次生代谢糖基转移酶(plant secondary product glycosyltransferase，PSPG)保守结构域，它能够识别和结合UDP糖供体。然而目前国内外对于能够用于催化人参皂苷生物合成的UGT酶报道较少。

技术实现思路

[0005]为了填补现有技术的空白，本专利技术提供一种UGT33基因，其具有催化人参皂苷糖链延伸的生物学功能，能够分别催化人参皂苷CK，人参皂苷Rh2、人参皂苷F1和人参皂苷F2生成相应的加糖产物。为了实现所述效果，本专利技术提供如下的技术方案：
[0006]本专利技术的第一个方面，提供一种UGT33基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
[0007]本专利技术的第二个方面，提供上述UGT33基因UGT33基因的编码蛋白，所述编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0008]本专利技术的第三个方面，提供上述UGT33基因和/或其编码蛋白在催化原人参二醇类化合物人参皂苷CK、Rh2和F2中的应用。
[0009]在一种实施方式中，上述应用为UGT33基因和/或其编码蛋白催化人参皂苷CK、Rh2和F2的C3位和C20位糖链延伸。
[0010]在一种实施方式中，上述应用为催化人参皂苷CK生成多糖苷Gypenoside LXXV、催化人参皂苷Rh2生成人参皂苷Rg3以及Gypenoside XVII，催化人参皂苷F2生成人参皂苷Rd和人参皂苷Rb1。
[0011]本专利技术的第四个方面，提供上述UGT33基因和/或其编码蛋白在催化原人参二醇类化合物人参皂苷F1中的应用。
[0012]在一种实施方式中，上述应用为催化原人参三醇类化合物人参皂苷F1的C20位糖链延伸。
[0013]在一种实施方式中，上述应用为催化原人参三醇类化合物人参皂苷F1生成双糖苷Yesanchinoside U。
[0014]本专利技术的第五个方面，提供上述UGT33基因和/或其编码基因在用于制备多糖苷Gypenoside LXXV、人参皂苷Rg3、Gypenoside XVII、人参皂苷Rd、人参皂苷Rb1和/或双糖苷Yesanchinoside U中的应用。
附图说明
[0015]附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：
[0016]图1 UGT33在三七植物不同年生不同组织部位的基因表达分析；
[0017]图2 pET28a
‑
UGT33重组蛋白胶图。BlueV Protein Marker(10
‑
190kDa)自上而下的顺序为：190kDa，140kDa，95kDa，70kDa，55kDa；甬道1为空载pET28a的对照蛋白，甬道2为pET28a
‑
UGT33的重组蛋白，甬道3为纯化后空载pET28a的对照蛋白，甬道4为纯化后pET28a
‑
UGT33的重组蛋白；
[0018]图3 UGT33分别催化人参皂苷CK和人参皂苷Rh2的酶促反应HPLC图谱。检测波长为203nm；
[0019]图4 UGT33催化人参皂苷F1的酶促反应TOF/MS图谱。A：UGT33催化人参皂苷F1生成Yesanchinoside U的反应式；B：反应产物TOF检测的TIC色谱图和质谱图。K
‑
F1表示pET28a空载蛋白的催化产物结果；UGT33
‑
F1表示UGT33重组蛋白的催化产物结果；图5UGT33催化人参皂苷F2的酶促反应TOF/MS图谱。A：UGT33催化人参皂苷F2生成相应加糖产物的反应式；B：反应产物TOF检测的TIC色谱图和质谱图。K
‑
F2表示pET28a空载蛋白的催化产物结果；UGT33
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F2表示UGT33重组蛋白的催化产物结果；
[0020]图6人参皂苷Gypenoside LXXV的1H NMR谱图(CD3OD
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种UGT33基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。2.如权利要求1所述的UGT33基因的编码蛋白，所述编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.一种如权利要求1所述的UGT33基因和/或如权利要求2所述的编码蛋白在用于催化原人参二醇类化合物人参皂苷CK、Rh2和F2中的应用。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用为UGT33基因和/或其编码蛋白催化人参皂苷CK、Rh2和F2的C3位和C20位糖链延伸。5.如权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述应用为催化人参皂苷CK生成多糖苷Gypenoside LXXV、催化人参皂苷Rh2生成人参皂苷Rg3以及Gypenoside XVII，催化人参皂苷F2生...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋州倩，高伟，黄璐琦，
申请(专利权)人：首都医科大学，
类型：发明
国别省市：