本发明专利技术属于基因工程技术领域，公开了一种ABO基因767位碱基替换诱导的剪接变体及应用。本发明专利技术使用c.767T>C hiPSC5细胞模型，利用全基因组测序和转录组测序技术对细胞模型进行检测；使用软件分析和生物信息分析对数据进行分析；利用体外反转录和TA克隆技术对新的剪接变体的产生进行验证。本发明专利技术的ABO基因767位碱基替换诱导的剪接变体，所述767位碱基替换为ABO基因第7外显子的C.767t>C取代，所述剪接变体的第4外显子有29bp插入或第6外显子有3bp缺失。本发明专利技术对血型的研究具有重要意义。本发明专利技术对血型的研究具有重要意义。本发明专利技术对血型的研究具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
一种ABO基因767位碱基替换诱导的剪接变体及应用
[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种ABO基因767位碱基替换诱导的剪接变体及应用。
技术介绍
[0002]Karl Landsteiner的ABO血型系统的发现是输血和器官移植安全的基础，这需要识别弱表型或亚群。该系统主要由红细胞表面是否存在碳水化合物抗原以及血清中相应的抗体来定义。ABO基因是控制这些血型抗原的最重要元素，由7个外显子组成，跨越约20个碱基对，编码糖基转移酶，合成红细胞表面和体液中的糖蛋白和糖脂。根据碳水化合物抗原的不同，ABO基因可分为三个等位基因，分别命名为A等位基因、B等位基因和O等位基因。A等位基因和B等位基因分别编码糖基转移酶A(GTA)和糖基转移酶B(GTB)，而O等位基因导致活性糖基转移酶的缺失。这三个等位基因组成了ABO血型系统的四种表型，包括A、B、O和AB。除此之外，在人群中已经发现了ABO表型的一些亚型，这些亚型表达的抗原或抗体减少，导致ABO正向和反向分型的差异。
[0003]许多已知的单核苷酸多态性(SNPs)、基于插入或删除的突变分布在ABO基因的7个外显子中，或位于影响转移酶活性的调节区域。ABO基因的变异可能会影响糖基转移酶的活性和特异性，导致ABO亚型甚至罕见血型的形成。罕见血型是指人类红细胞中缺少常见血型抗原，包括Rh、MNS、Lewis、Diego、Kell、Kidd、Duffy系统等。稀有血型特别是稀有亚型的血液储存量较少，输血时应特别注意。
[0004]有报道说ABO基因第7外显子的C.767t>C取代，会导致密码子256处的异亮氨酸变为苏氨酸，导致a抗原表达减少，产生一个罕见的ABO*Ael05/B101亚型。新的罕见ABO*Ael05/B101亚型难以通过常规表型鉴定，在世界范围内仅出现少数病例。这种罕见的血型在血液资源和输血策略上更加受到重视。有必要研究ABO基因C 767t>C取代的机制，为临床指导Ael亚型输血提供依据。另外，ABO基因C767t>C取代是否会影响全基因组水平尚不清楚，有待进一步研究。
技术实现思路
[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种ABO基因767位碱基替换诱导的剪接变体及应用。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下：
[0007]第一方面，本专利技术提供一种ABO基因767位碱基替换诱导的剪接变体，所述767位碱基替换为ABO基因第7外显子的C.767t>C取代，所述剪接变体的第4外显子有29bp插入或第6外显子有3bp缺失。
[0008]本专利技术利用剪接转录本分析和TA克隆技术，在ABO C767t>C取代的hiPSC5中观察到剪接变异体的产生，与ABO亚型的形成有关联。利用全基因组和转录组测序手段，可以清晰的阐明碱基替换对细胞基因组和转录组的影响，数据多样且准确；使用软件对可能存在
的剪接位点进行提前分析，提供一种新的实验思路；本专利技术发现ABO基因767位碱基替换诱导新的剪接变体的产生，对血型研究具有重要意义。
[0009]作为本专利技术所述的剪接变体的优选实施方式，所述插入为：由CATGGCTGTTAGGGAACCTGACCATCTGCAGCGCGTCTCGTTGCCAAG突变为CAGCTGGAGTGATCTTTCCAGAACATAAGCATGGCTGTTAGGGAACCTGACC ATCTGCAGCGCGTCTCGTTGCCAAG。
[0010]作为本专利技术所述的剪接变体的优选实施方式，所述缺失为：第6外显子起始位置的TAG碱基缺失。
[0011]第二方面，本专利技术提供一种所述的剪接变体的诱导方法，包括以下步骤：
[0012](1)采用ABE编辑系统和sgRNA对ABO基因767位碱基进行T突变C，筛选克隆得到ABO基因c.767T>C的突变细胞；
[0013](2)分析所述突变细胞全基因组测序数据中indel和SNP的数量和/或频率；分析所述突变细胞转录组测序数据中的差异表达基因；
[0014](3)提取所述突变细胞的RNA，反转录得cDNA；
[0015](4)分析cDNA的ABO基因的剪接位点，即得剪接变体。
[0016]作为本专利技术所述的剪接变体的诱导方法的优选实施方式，所述sgRNA的核苷酸序列为gtcccaggcctacatcccca。
[0017]作为本专利技术所述的剪接变体的诱导方法的优选实施方式，在步骤(4)中，对所述cDNA进行PCR扩增和TA克隆连接。
[0018]作为本专利技术所述的剪接变体的诱导方法的优选实施方式，所述PCR的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
[0019]第三方面，本专利技术提供一种血型鉴定的试剂盒，包括检测引物对，所述检测引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
[0020]第四方面，本专利技术将上述的剪接变体、上述的诱导方法在血型鉴定中应用。
[0021]作为本专利技术所述的应用的优选实施方式，所述血型鉴定为ABO*Ael05/B101亚型表型鉴定。
[0022]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
[0023]本专利技术利用剪接转录本分析和TA克隆技术，在ABO C767t>C取代的hiPSC5中观察到剪接变异体的产生，与ABO亚型的形成有关联。利用全基因组和转录组测序手段，可以清晰的阐明碱基替换对细胞基因组和转录组的影响，数据多样且准确；使用软件对可能存在的剪接位点进行提前分析，提供一种新的实验思路；本专利技术发了现ABO基因767位碱基替换诱导新的剪接变体的产生，对血型研究具有重要意义。
附图说明
[0024]图1为hiPSC5和WT样本的全基因组测序数据中indel和SNP的数量比对结果；
[0025]图2为hiPSC5和WT样本的全基因组测序数据中indel和SNP的频率比对结果；
[0026]图3为hiPSC5与参考人类基因组的SNV比对分析结果；
[0027]图4为人染色体上SNP在hiPSC5和WT hiPS细胞中的分布示意图；
[0028]图5为SNP在hiPSC5和WT hiPS细胞中的对比结果图；
[0029]图6为以WT为参考hiPSC5中上调和下调基因表达的数量分析结果；
[0030]图7为hiPSC 5和WT的转录本分析结果；
[0031]图8为hiPSC 5和WT的剪接模式分析结果。
具体实施方式
[0032]为更好地说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本专利技术作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0033]实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种ABO基因767位碱基替换诱导的剪接变体，所述767位碱基替换为ABO基因第7外显子的C.767t>C取代，其特征在于，所述剪接变体的第4外显子有29bp插入或第6外显子有3bp缺失。2.根据权利要求1所述的剪接变体，其特征在于，所述插入为：由CATGGCTGTTAGGGAACCTGACCATCTGCAGCGCGTCTCGTTGCCAAG突变为CAGCTGGAGTGATCTTTCCAGAACATAAGCATGGCTGTTAGGGAACCTGACC ATCTGCAGCGCGTCTCGTTGCCAAG。3.根据权利要求1所述的剪接变体，其特征在于，所述缺失为：第6外显子起始位置的TAG碱基缺失。4.权利要求1所述的剪接变体的诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)采用ABE编辑系统和sgRNA对ABO基因767位碱基进行T突变C，筛选克隆得到ABO基因c.767T>C的突变细胞；(2)分析所述突变细胞全基因组测序数据中indel和SNP的数量和/...
【专利技术属性】
技术研发人员：金银戈，韩东旭，周小青，郑伟，席嘉慧，宁丽，鹿璇，高月，李双鹏，吴曼虹，唐成程，邹庆剑，陈敏，江晓汕，赖良学，
申请(专利权)人：五邑大学，
类型：发明
国别省市：
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