生产3-脱氢莽草酸的重组微生物及其构建方法与应用技术

本公开涉及生产3

【技术实现步骤摘要】
生产3
‑
脱氢莽草酸的重组微生物及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及生产3
‑
脱氢莽草酸的重组微生物及其构建方法，以及前述重组微生物在制备3
‑
脱氢莽草酸中的应用。

技术介绍

[0002]3‑
脱氢莽草酸(3
‑
dehydroshikimate，DHS)是微生物及植物体内芳香族氨基酸生物合成代谢途径中的一种重要中间产物，对维系生物正常发育、完成代谢过程具有重要作用。DHS可被进一步催化形成莽草酸(Shikimate)及其芳香族氨基酸和衍生物，以及原儿茶酸(Protocatechuate)、香草醛(Vanillin)、儿茶酚(Catechol)、没食子酸(Gallate)、已二酸(Adipate)、水杨酸(Salicylic acid)等一系列重要化工产品。利用3
‑
脱氢莽草酸合成这些化工产品可以避免有毒的苯和甲苯等原料的使用，减少对人体和环境影响。与此同时，3
‑
脱氢莽草酸还是一种十分有效的抗氧化剂，其活性甚至优于没食子酸、没食子酸丙酯(Propyl gallate)、对苯二酚(BHQ)、丁羟甲苯(BHT)、生育酚(α
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tocopherol)等一些商品化的抗氧化剂，具有重要的应用价值。此外，DHS作为一种小分子手性化合物，还可以作为药物合成中非常有潜力的合成中间体。因此，研究DHS的生产具有重要的应用前景。
[0003]目前，利用微生物生产DHS最主要报道的文献有以下3篇现有技术文献。
[0004]现有技术文献1在突变aroE的E.coli AB2834中利用质粒表达系统过表达tktA/glf/glk/aroF/aroB，5L发酵罐放大发酵DHS产量达到69g/L。前述发酵过程中的发酵培养基中包含如下组分：磷酸氢二钾7.5g/L，柠檬酸铁铵0.3g/L，一水柠檬酸2.1g/L，芳香族氨基酸和维生素，微量元素以及葡萄糖。其通过过表达tktA增加DHS前体E4P供给，通过PTS系统替换为glf/glk增加DHS另一个前体PEP供给，通过突变aroE阻断DHS降解(通过添加复杂培养基成分维持生长)以及通过过表达aroF
fbr
/aroB强化DHS合成途径。
[0005]但是，现有技术文献1的技术方案存在如下缺陷：(1)发酵培养基成分复杂(需要添加多种芳香族氨基酸以及维生素等必须成分)：由于在大肠杆菌中突变aroE(相当于敲除aroE)时，细胞因为无法合成生长必需的芳香族氨基酸导致细胞无法正常生长，需要额外添加复杂的营养物质维持细胞生长；(2)发酵过程繁琐：由于需要额外添加芳香族氨基酸以及维生素，因此需要进行过滤除菌操作；(3)遗传不稳定性以及增加细胞代谢负担：质粒系统过表达相关基因时，会导致细胞除了维持正常生长还需要承担质粒系统带来的代谢负担；(4)DHS产量与转化率不高：因为细胞内代谢网络的复杂性以及刚性，利用质粒系统过表达相关基因并不会充分扰动代谢网络偏向DHS的生物合成，进而导致碳源
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葡萄糖等仅有一部分流向DHS合成途径；(5)生产成本较高：需要添加大量的芳香族氨基酸以及微量元素、DHS产量与转化率低。
[0006]现有技术文献2公开了在敲除aroE的E.coli AB2834中先后敲除tyrR/ptsG/pykA，基因组水平上过表达aroB/aroD/ppsA/galP/aroG/aroF，在7L发酵罐中发酵120小时产量达到目前文献报道的最高水平117g/L。前述发酵过程中的发酵培养基包含如下组分：葡萄糖30g/L，甘油10g/L，酵母抽提物15.75g/L，胰蛋白胨21.375g/L，磷酸氢二钾5.25g/L，七水硫
酸镁1g/L，柠檬酸0.8g/L，1mL/L微量元素以及200μg/L盐酸硫胺素。前述发酵过程中的发酵培养基包含如下组分：600g/L葡萄糖，100g/L酵母抽提物，20g/L七水硫酸镁，以及微量元素，转化率为0.39g/g葡萄糖。其通过PTS系统替换为glf/glk、过表达ppsA、敲除pykA增加DHS前体PEP供给，通过敲除aroE阻断DHS降解(通过添加复杂培养基成分维持生长)以及通过过表达aroF/aroG/aroB/aroD强化DHS合成途径。
[0007]但是，现有技术文献2的技术方案同样存在如下缺陷：(1)发酵培养基成分复杂(需要添加大量的酵母抽提物等复杂培养基成分)：由于在大肠杆菌中敲除aroE，细胞因为无法合成生长必需的芳香族氨基酸导致细胞无法正常生长，需要额外添加复杂的营养物质维持细胞生长；(2)发酵所需的流加培养基成分复杂：敲除aroE导致的维持细胞生长所需；(3)发酵周期过长：发酵120小时，可能是由于流加培养基每次流加时酵母抽提物含量低；(4)DHS转化率不高：在发酵过程中，除了葡萄糖以外，还存在甘油、胰蛋白胨以及酵母抽提物等可作为碳源的的营养物质，而现有技术文献2中仅报道了DHS对葡萄糖的转化率(0.39g/g)；(5)生产成本高：发酵培养基中大量的复杂培养基成分(酵母抽提物、胰蛋白胨)、发酵周期长、DHS转化率低。
[0008]现有技术文献3公开的技术方案中，包括在E.coli ATCC8739中利用杂合启动子元件(P1)表达aroE(而非敲除，避免发酵培养基中添加复杂培养基成分)，敲除tyrR/ptsI，调控aroF
fbr
表达(P2)过表达tktA(P3)，组合调控大肠本底基因glk/galP表达、弱化pykF/pykA/pgi表达(P1)，实现了大肠杆菌在简单无机盐发酵培养基中发酵52小时产量达到94.4g/L，转化率为32.65％M/M。其通过PTS系统替换为glf/glk、同时弱化pykA/pykF增加DHS前体PEP供给，通过基因组过表达tktA增加DHS前体E4P供给，通过弱化aroE积累DHS的同时维持细胞生长，调控aroF
fbr
表达强化DHS合成途径。
[0009]但是，现有技术文献3同样存在转化率不够高，以及生产成本不够低的缺陷。
[0010]总之，上述现有技术文献中所公开的技术方案虽然可以生产DHS，但其生产成本仍然较高，并且其生产DHS的转化率仍然有待提高。
[0011]现有技术文献
[0012]1.Altered Glucose Transport and Shikimate Pathway Product Yields in E.coli，Jian Yi et.al.，BIOTECHNOLOGY PROGRESS，(2003)
[0013]2.Cell Factory Design and Culture Process Optimization for Dehydroshikimate Biosynthesis in Escherichia coli，Si
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Sun Choi et.al.，Front.Bioeng.本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于3
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脱氢莽草酸生产的重组微生物，其中，所述重组微生物与野生型微生物或出发菌株相比，具有如下(a)、(b)、(c)所示的特性：(a)增强的磷酸转酮酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；(b)增强的磷酸乙酰基转移酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；和(c)降低或消失的乙酸激酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平。2.根据权利要求1所述的重组微生物，其中，在野生型微生物或出发菌株中，插入编码磷酸转酮酶的基因，以增强磷酸转酮酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；在起始磷酸乙酰基转移酶翻译的起始密码子的上游插入调控元件P3，以增强磷酸乙酰基转移酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；或敲除编码乙酸激酶的基因，以降低或消失乙酸激酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；其中，所述调控元件P3的序列如SEQ ID NO：1所示。3.根据权利要求1
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2任一项所述的重组微生物，其中，所述重组微生物与野生型微生物或出发菌株相比，还具有如下(d)所示的特性：(d)增强的脱氢奎尼酸合成酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；可选的，在起始脱氢奎尼酸合成酶翻译的起始密码子的上游插入调控元件P3，以增强脱氢奎尼酸合成酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；优选的，编码所述脱氢奎尼酸合成酶基因的核酸序列如SEQ ID NO：11所示。4.根据权利要求3所述的重组微生物，其中，所述重组微生物与野生型微生物或出发菌株相比，还具有如下(e)所示的特性：(e)降低或消失的丙酮酸激酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；可选的，将野生型微生物或出发菌株中表达丙酮酸激酶的基因敲除，以使得野生型微生物或出发菌株中丙酮酸激酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平降低或消失。5.根据权利要求4所述的重组微生物，其中，所述重组微生物与野生型微生物或出发菌株相比，还具有如下(f)、(g)、(h)、(j)或(k)所示的特性：(f)降低或消失的丙酮酸脱氢酶E1的酶活性和/或其编码基因的表达水平；(g)在所述重组微生物的基因组中插入编码Esal蛋白和编码EsaR
I70V
蛋白的核酸序列，以及在编码丙酮酸脱氢酶E1的基因的上游插入PeasR
‑
C启动子的核酸序列；(h)降低或消失的葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；(j)降低或消失的葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平，增强的NAD(P)依赖的甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平，增强的葡萄糖
‑6‑
磷酸异构酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平，和降低或消失的甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；(k)在所述重组微生物的基因组中插入编码Esal蛋白和编码EsaR
I70V
蛋白的核酸序列，在编码丙酮酸脱氢酶E1的基因的上游插入PeasR
‑
C启动子的核酸序列；和降低或消失的葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；可选的，对于(f)，在起始丙酮酸脱氢酶E1翻译的起始密码子的上游插入调控元件P1，或进一步
将所述调控元件P1的起始密码子由ATG突变为TTG，以降低或消失丙酮酸脱氢酶E1的酶活性和/或其编码基因的表达水平；对于(h)，在起始葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶翻译的起始密码子的上游插入调控元件P1，或进一步将所述调控元件P1的起始密码子由ATG突变为GTG，以降低或消失葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；对于(j)，将野生型微生物或出发菌株中表达葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶的基因敲除，以降低或消失葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；在起始NAD(P)H依赖的甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶翻译的起始密码子的上游插入调控元件P3，以增强NAD(P)H依赖的甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；在起始甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶翻译的起始密码子的上游插入调控元件P1，以降低或消失甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；和在起始葡萄糖
‑6‑
磷酸异构酶翻译的起始密码子的上游插入调控元件P2，或进一步将所述调控元件P2的起始密码子由ATG突变为GTG；对于(k)，在所述重组微生物的基因组中插入编码Esal蛋白和编码EsaR
I70V
蛋白的核酸序列，在编码丙酮酸脱氢酶E1的基因的上游插入PeasR
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C启动子的核酸序列；和在起始葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶翻译的起始密码子的上游插入调控元件P1，或进一步将所述调控元件P1的起始密码子由ATG突变为GTG，以降低或消失葡萄糖
‑6‑
磷酸脱氢酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平；其中，所述编码Esal蛋白的核酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述编码EsaR
I70V
蛋白的核酸序列如SEQ ID NO：3所示；所述PeasR
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C启动子的核酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述调控元件P1的核酸序列如SEQ ID NO：5所示；所述调控元件P2的核酸序列如SEQ ID NO：6所示。6.一种用于3
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脱氢莽草酸生产的重组微生物的制备方法，其中，所述方法包含如下步骤：(a1)相较于野生型微生物或出发菌株，增强磷酸转酮酶的酶活性和/或其编码基因的表达水平的步骤；和(b1)相较于野生型微生物或出发菌株，增强磷酸乙酰基转移酶的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王钦宏，宋国田，陈五九，江小龙，吴凤礼，彭彦峰，张媛媛，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：