一种NADH激酶基因RkNADHK1及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种分离自红冬孢酵母(Rhodosporidium kratochvilovae)YM25235的NADH激酶基因RkNADHK1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；将该基因与载体连接，转入红冬孢酵母细胞中，实验结果显示RkNADHK1基因的过表达能够促进红冬孢酵母合成类胡萝卜素；本发明专利技术为大规模商业化生产类胡萝卜素提供参考。大规模商业化生产类胡萝卜素提供参考。大规模商业化生产类胡萝卜素提供参考。

【技术实现步骤摘要】
一种NADH激酶基因RkNADHK1及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种NADH激酶基因RkNADHK1及其在提高红冬孢酵母(Rhodosporidium kratochvilovae)类胡萝卜素产量中的应用。

技术介绍

[0002]NAD激酶(EC 2.7.1.23)可通过磷酸化供体(ATP和/或无机多磷酸[ploy(P)])催化NAD
+
生成NADP
+
，而NADH激酶(EC 2.7.1.86)则可利用ATP和/或[ploy(P)]催化NAD(H)合成NADP(H)，两者构成NADP(H)生物合成的最后一步(McGuinness ET,Butler JR.NAD+kinase
‑‑
areview.Int J Biochem.1985；17(1):1
‑
11.doi:10.1016/0020
‑
711x(85)90079
‑
5)。在真核模式生物酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中存在三种NAD激酶，分别位于胞质的Utr1p、Yef1p和位于线粒体基质的Pos5p，当前的研究显示三者只能利用ATP作为磷酸供体催化NAD(H)合成NADP(H)，均被鉴定为ATP
‑
NADH激酶，对细胞内的NADP(H)的供应起着重要作用(Shi F,Kawai S,Mori S,Kono E,Murata K.Identification of ATPr/>‑
NADH kinase isozymes and their contribution to supply of NADP(H)in Saccharomyces cerevisiae.FEBS J.2005；272(13):3337
‑
3349.doi:10.1111/j.1742
‑
4658.2005.04749.x)。
[0003]NADPH(Reduced Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate)作为多种生物代谢途径中的重要还原力，是几种高价值物质生物合成的必要辅因子，包括类异戊二烯、脂肪酸和胆固醇等。许多研究显示通过改善细胞内NADPH含量，可有效促进萜类物质的合成，如Zhao等在可产类胡萝卜素的重组酿酒酵母中过表达POS5基因与类胡萝卜素合成途径中的八氢番茄红素脱氢酶基因(CrtI)，通过提高细胞内NADPH的含量，促进了类胡萝卜素合成通路中相关基因的表达，进而使得胞内类胡萝卜素的含量显著提高。
[0004]类胡萝卜素(Carotenoids)是一种用途广泛的异戊二烯类(又称萜类)色素，是由植物、真菌、藻类和细菌合成的种类最多的次生代谢物之一。类胡萝卜素存在于细胞膜系统中，与细胞的胁迫应激反应有关，一般呈黄色、橙红色、红色或紫色，具有维生素A原活性、较强的抗氧化性、抗癌能力和调节免疫功能等。因此，类胡萝卜素在医药、保健、食品等领域受到研究者极大的关注。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种从红冬孢酵母(Rhodosporidium kratochvilovae)YM25235中分离获得NADH激酶基因RkNADHK1及其用途，基因RkNADHK1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该基因序列长为2055bp，编码氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的多肽，将该基因与载体连接，转入红冬孢酵母细胞中，这个基因表达水平的提高促进了类胡萝卜素的合成。
[0006]本专利技术目的通过以下技术方案实现：
[0007]1、从红冬孢酵母YM25235中提取总RNA，然后反转录合成cDNA，以合成cDNA为模板，采用扩增RkNADHK1基因的特异引物，通过聚合酶链式反应扩增获得目的序列，将载体
pRH2034进行双酶切、回收，用一步克隆法将目的片段和载体连接，获得连接产物重组质粒pRHRkNADHK1，将重组质粒pRHRkNADHK1转入大肠杆菌中，通过PCR筛选出阳性单克隆，重组质粒pRHRkNADHK1用BamHⅠ、EcoR
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两个限制性内切酶进行酶切验证，验证阳性的克隆子培养后提取质粒，测序，获得片段大小为2055bp的RkNADHK1基因片段；
[0008]2、利用PEG介导的原生质体法将重组载体pRHRkNADHK1转化至红冬孢酵母YM25235中，筛选转化子，获得含有pRHRkNADHK1的过表达菌株，含有pRHRkNADHK1的过表达菌株经培养，提取色素，利用紫外
‑
可见分光光度计测量总类胡萝卜素的含量。
[0009]本专利技术利用的红冬孢酵母YM25235菌株具有原料成本低、生产周期短、遗传稳定、安全性高等优点，从该菌株中提取的总RNA反转录的cDNA中克隆得到NADH激酶基因RkNADHK1，通过基因工程手段对红冬孢酵母进行改造，红冬孢酵母YM25235中RkNADHK1基因的过表达引起细胞内这个基因转录水平的提高，继而翻译成相应蛋白，引起细胞内NADPH含量的增加，最终使得过表达菌株细胞内类胡萝卜素含量的显著提高。本研究结果有助于阐明红冬孢酵母YM25235中产类胡萝卜素的机制，为揭示微生物提高类胡萝卜素产量的机制提供参考，本专利技术提供了一种生产类胡萝卜素的新方法，方法简单，操作简便，对类胡萝卜素的工业化生产提供良好的应用前景和经济效益，同时为进一步基于辅因子进行的类胡萝卜素高产菌株和工艺化生产类胡萝卜素的研究与应用提供参考。
附图说明
[0010]图1为本专利技术的红冬孢酵母YM25235的RkNADHK1基因的PCR扩增图；1.DNA分子量标记DL5000；2.阴性对照；3.基因RkNADHK1的cDNA片段；
[0011]图2为重组质粒pRHRkNADHK1的质粒图谱；
[0012]图3为菌落PCR验证电泳图；1.DNA分子量标记DL5000；2.阴性对照；3.基因RkNADHK1的cDNA片段；4
‑
8为转化子；
[0013]图4为重组质粒pRHRkNADHK1限制性酶切分析；其中：1.DNA分子量标记DL10000；2.阴性对照；3.质粒pRH2034的BamHI和EcoRV双酶切；4.重组质粒pRHRkNADHK1的BamHI、EcoRV双酶切；5.基因RkNADHK1的cDNA片段；6.DNA分子量标记DL2000；
[0014]图5为重组质粒pRHRkNADHK1转化红冬孢酵母YM25235阳性克隆验证，其中1.DNA分子标量DL2000；2.阴性对照；3.以YM25235基因组扩增的PCR产物；4.以质粒pRHRkNADHK1扩增的PCR产物；5.以YM25235/pRHRkNADHK1菌株基因组扩增的PCR产物；
[0015]图6为过表达菌株YM25235/pRHRkNADHK1与对照菌株YM25235的NADPH含量比较结果；<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种NADH激酶基因RkNADHK1，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.权利要求1所述的NADH激酶基因RkN...

【专利技术属性】
技术研发人员：张琦，甘雨萱，陈汝艺，邱婧雯，陈媛，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：