兼备抗吞噬及肿瘤靶向能力的外泌体载药系统及其制备与应用技术方案

本发明专利技术公开了一种兼备抗吞噬及肿瘤靶向能力的外泌体载药系统及其制备与应用，肿瘤靶向基团通过融合蛋白的接头柔性连接到具有抗吞噬能力跨膜蛋白的细胞膜外侧，设计融合基因序列，插入到表达载体中，形成融合表达载体，再整合到待改造细胞的染色体中获得稳定表达融合蛋白的工程化细胞，用于分泌工程化外泌体。待改造的细胞包括裸细胞(永生化细胞系、原代细胞)、稳定表达治疗性核酸分子或蛋白的工程化细胞，前者细胞产生的外泌体可进一步包装治疗性分子治疗肿瘤，后者细胞产生的外泌体可分离纯化收集后直接用于肿瘤的治疗。本发明专利技术生产的工程化外泌体在体内的半衰期显著延长，提高治疗效果，并且在体内外显示出较强肿瘤靶向性和抗肿瘤效果。和抗肿瘤效果。和抗肿瘤效果。

【技术实现步骤摘要】
兼备抗吞噬及肿瘤靶向能力的外泌体载药系统及其制备与应用


[0001]本专利技术属于生物医药工程
，具体涉及一种兼备抗吞噬及肿瘤靶向能力的外泌体载药系统及其制备与应用。

技术介绍

[0002]癌症的发病率和死亡率至今逐年攀升，严重威胁着人类的健康。
[0003]基于外泌体药物递送系统而开发的肿瘤给药治疗是继手术治疗、放射治疗、化学治疗、靶向治疗、免疫治疗后的第六种癌症治疗模式。外泌体是由大多数细胞分泌的具有双层膜结构的囊泡，大小在30～150nm；外泌体可特异性富集细胞内核酸、蛋白质、脂质等各种生物分子，进而传递给受体细胞并对其进行调控。因为外泌体来源于机体细胞，它的免疫原性低，再加上它的粒径小、生物利用度高，可以将各种药物(包括疏水性药物等)包裹后自由穿过生理屏障而到达肿瘤深处，在被肿瘤细胞摄取后，释放出药物杀伤肿瘤。通过在临床试验官方网站clinicaltrials.gov进行检索，利用“exosomes”和“cancer”作为关键词进行检索，查询到借助外泌体进行药物的肿瘤给药的临床研究仅仅只有3项(NCT01294072，NCT01668849，NCT03608631)，而其中2项都是利用植物来源的外泌体，可见利用外泌体进行肿瘤给药作为肿瘤给药治疗的新兴技术手段，其临床相关的研究尚处于起步阶段，具有重要的研究意义和广阔的应用前景。
[0004]近些年，有大量的临床前研究报道，利用外泌体作为药物递送系统进行肿瘤治疗。主要分为两大类：1.因为牛奶和血清易得，外泌体产量高，但是外泌体不含药物且缺乏靶向能力，因此在获得牛奶外泌体或血清外泌体后，需要对其进行靶向修饰和药物装载，之后再进行抗肿瘤研究。2.为了简化后续加工过程，研究人员倾向于正常细胞来源的外泌体，首先对细胞进行基因工程改造，使细胞能稳定表达抗肿瘤核酸分子(此方案工程化改造居多)，在培养好细胞后大量收集细胞来源的外泌体，这些外泌体中大量富集抗肿瘤核酸分子，随后对外泌体进行肿瘤靶向基团的修饰，再进行抗肿瘤研究；另外还可以对外泌体膜蛋白进行修饰使细胞稳定表达靶向分子，产生的外泌体携带肿瘤靶向基团，之后再进行药物装载，也可以获得肿瘤靶向递药外泌体。但是上述方案在临床应用中前处理相对比较繁琐，不容易实施。另外随着研究的不断深入，研究人员也发现了外泌体递药系统在血液循环中容易被内皮网状系统(RES系统)吞噬清除，Matsumoto等人的研究发现，当给小鼠尾静脉注射外泌体药物时，3h后，血液中外泌体的含量不足5％，大部分累积在肝脏和脾脏中，极少可到达病灶，可见普通的外泌体在体内运输时，其半衰期大大缩短，从而降低了治疗效果。
[0005]外泌体载药系统要在临床上得到应用，需建立一套完整的工业化大规模生产工艺。据报道，细胞培养方法生产外泌体更适用于大规模生产，该方法具有许多的优势，如：培养工艺易控制、产生的外泌体质控好等。前文提到的目前外泌体的临床前研究如火如荼，但是临床研究还处于起步阶段，最大的原因就是外泌体的大规模生产工艺还没建立完全，还仅仅停留在实验室细胞培养皿(瓶)培养阶段，其产量供不应求，生产成本高。

技术实现思路

[0006]专利技术目的：为了克服现有技术中存在的不足，本专利技术提供了一种兼备抗吞噬及肿瘤靶向能力的外泌体载药系统及其制备与应用，尤其是一种便捷生产抗肿瘤外泌体药物的方法，利用该方法只需对工程化改造的细胞进行培养，收集培养液后从培养液中分离纯化工程化外泌体，这些外泌体的表面自身修饰有肿瘤靶向基团，且当采用稳转株作为工程化细胞时，所得的外泌体自身便携带有抗肿瘤效应分子，省去了现有技术后续对外泌体进行药物装载和靶向修饰以及再次纯化等繁琐过程。利用本专利技术提供的技术即可快速实现外泌体靶向载药系统的临床应用。
[0007]技术方案：为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：
[0008]本专利技术的第一个目的是，提供一种兼备抗吞噬及肿瘤靶向能力的外泌体载药系统，所述外泌体载药系统为表面修饰有通过抗吞噬蛋白连接肿瘤靶向基团的工程化外泌体，所述工程化外泌体由工程化细胞分泌，所述工程化细胞稳定表达融合蛋白；
[0009]所述工程化细胞包括染色体整合有融合表达载体的工具细胞，所述工具细胞包括裸细胞及可表达抗肿瘤效应分子稳转株其中任意一种，所述融合表达载体为插入了融合基因序列的表达载体，所述融合基因序列由肿瘤靶向基团通过融合蛋白的接头柔性连接到具有抗吞噬能力跨膜蛋白的细胞膜外侧形成。所述的裸细胞及可表达抗肿瘤效应分子的工具细胞即为待改造细胞。
[0010]可选的，在本专利技术的一种实施方式中，所述肿瘤靶向基团为包括纳米抗体、传统抗体、单链可变片段(scFv)、靶向肽在内的任意一种生物大分子，其中，所述传统抗体包括EGFR抗体(如西妥昔单抗)、HER2抗体(如曲妥珠单抗)等。
[0011]可选的，在本专利技术的一种实施方式中，所述融合蛋白的接头为包括(GGGGS)nlinker、(G)n linker在内的其中任意一种柔性连接臂。
[0012]可选的，在本专利技术的一种实施方式中，所述具有抗吞噬能力的跨膜蛋白包括但不限于CD47分子、CD24分子、MHC
‑
I分子等其中任意一种抑制网状内皮系统(RES系统)、DC细胞吞噬的细胞跨膜蛋白。
[0013]可选的，在本专利技术的一种实施方式中，所述表达载体基本骨架包括但不限于慢病毒表达载体、腺病毒表达载体其中任意一种。
[0014]可选的，在本专利技术的一种实施方式中，所述工程化裸细胞(永生化细胞系、原代细胞)包括正常细胞系或免疫细胞，其中，正常细胞系包括但不限于HEK293细胞系、HEK293T细胞系、NK92细胞系、NK92MI细胞系其中任意一种，所述免疫细胞包括但不限于人原代NK细胞、巨噬细胞、中性粒细胞其中任意一种。
[0015]可选的，在本专利技术的一种实施方式中，所述可稳定表达抗肿瘤效应分子的稳转细胞为稳定表达抗肿瘤的miRNA、lncRNA、circRNA、mRNA的工程化细胞。
[0016]可选的，在本专利技术的一种实施方式中，所述可稳定表达抗肿瘤效应分子的稳转细胞包括但不限于miR204
‑
5p、miR139
‑
5p、CircMTO1其中任意一种。
[0017]本专利技术的第二个目的是，提供一种兼备抗吞噬及肿瘤靶向能力的外泌体载药系统的制备方法，利用构建好的融合表达质粒对工具细胞进行工程化改造，进一步利用工程化细胞生产抗肿瘤外泌体药物。
[0018]一种兼备抗吞噬及肿瘤靶向能力的外泌体载药系统，需要构建融合表达质粒，该
质粒核心部位表现为，表达出的蛋白质以抗吞噬跨膜蛋白为桥梁，将肿瘤靶向基团通过融合蛋白接头柔性连接到抗吞噬跨膜蛋白细胞膜外侧，之后将该融合表达质粒人工整合到工具细胞的染色体上，获得稳定表达细胞株，所述工具细胞为裸细胞或者稳定表达抗肿瘤核酸药物的正常细胞系或原代细胞，所述稳定表达细胞株可在培养后，从培养液中分离纯化肿瘤靶向载药的外泌体，进一步制成抗肿瘤纳米药物制剂，可直接应用于临床。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种兼备抗吞噬及肿瘤靶向能力的外泌体载药系统，其特征在于，所述外泌体载药系统为表面修饰有通过抗吞噬蛋白连接肿瘤靶向基团的工程化外泌体，所述工程化外泌体由工程化细胞分泌，所述工程化细胞稳定表达融合蛋白；所述工程化细胞为染色体整合有融合表达载体的工具细胞，所述工具细胞包括裸细胞及可表达抗肿瘤效应分子的稳转细胞其中任意一种，所述融合表达载体为插入了融合基因序列的表达载体，所述融合基因序列由肿瘤靶向基团通过融合蛋白的接头柔性连接到具有抗吞噬能力跨膜蛋白的细胞膜外侧形成。2.根据权利要求1所述的外泌体载药系统，其特征在于，所述肿瘤靶向基团为包括纳米抗体、传统抗体、单链可变片段scFv、靶向肽在内的任意一种生物大分子，其中，所述传统抗体包括但不限于EGFR抗体、HER2抗体其中任意一种；所述融合蛋白的接头为包括(GGGGS)n linker、(G)n linker在内的任意一种柔性连接臂；所述抗吞噬蛋白为具有抗吞噬能力的跨膜蛋白，包括CD47分子、CD24分子、MHC
‑
I分子在内的任意一种抑制网状内皮系统、DC细胞吞噬的细胞跨膜蛋白；所述表达载体包括但不限于慢病毒表达载体、腺病毒表达载体其中任意一种。3.根据权利要求1所述的外泌体载药系统，其特征在于，所述裸细胞包括正常细胞系及免疫细胞，其中，正常细胞系包括但不限于HEK293细胞系、HEK293T细胞系、NK92细胞系、NK92MI细胞系，所述免疫细胞包括但不限于人原代NK细胞、巨噬细胞、中性粒细胞；所述可稳定表达抗肿瘤效应分子的稳转细胞为稳定表达抗肿瘤的miRNA、lncRNA、circRNA、mRNA的工程化细胞。4.一种兼备抗吞噬及肿瘤靶向能力的外泌体载药系统的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、肿瘤靶向基团通过融合蛋白的接头柔性连接到具有抗吞噬能力跨膜蛋白的细胞膜外侧，形成融合蛋白基因序列；S2、所述融合蛋白基因序列插入到表达载体中，形成融合表达载体；S3、所述融合表达载...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄朝晖，龚亮，吴志猛，田璐，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：