利用拉曼光谱的病原活菌快速计数方法及系统技术方案

本发明专利技术公开了一种利用拉曼光谱的病原活菌快速计数方法及系统，该方法包括以下步骤：S1、制备培养基，所述培养基中包括培养基母液、标记物以及生长抑制剂；S2、利用步骤S1制备的培养基对待测样本进行培养；S3、对经步骤S2培养后的待测样本进行拉曼光谱采集，并根据拉曼特征峰识别病原活菌；S4、根据步骤s3的结果对病原活菌进行计数。本发明专利技术提供的利用拉曼光谱的病原活菌快速计数方案能够有效克服传统方案存在的尿路感染中病原活菌计数所需培养时间长、效率低和操作复杂等缺陷，以及常规拉曼光谱结合重水标记技术存在的准确性不够的缺陷，本发明专利技术能够实现尿路感染样本中病原活菌的快速计数，在短时间内为医生提出更可靠的计数结果。结果。结果。

【技术实现步骤摘要】
利用拉曼光谱的病原活菌快速计数方法及系统


[0001]本专利技术涉及病原菌检测
，特别涉及一种利用拉曼光谱的病原活菌快速计数方法及系统。

技术介绍

[0002]尿路感染是最常见的病原菌感染疾病之一，全世界范围内每年有1.5亿左右人口受其影响。根据统计，50％的女性人口和10％的男性人口在一生中至少患得一次尿路感染。用于病原微生物计数的分离富集培养法自1950年以来一直是临床尿路感染诊断的金标准：当尿液中病原菌含量超过105CFU/mL时，可以判断为尿路感染。这种方法可以有效地识别尿液样本中的病原活菌，进而确定致病病原菌。但是，这种传统的金标准依赖于长时间的隔夜培养与分纯，其从“样本”到“报告”的诊断时间往往长达18个小时，整体流程参照图7。较长的诊断时间延误了诊断的时机，临床中出现了较多的凭经验用药现象，进而造成了抗生素的滥用，乃至细菌耐药性问题的发展和蔓延。
[0003]确定尿液样本中具有代谢活性的病原菌种属信息是临床确定使用抗生素种类、防止抗生素滥用的先行条件。目前，除分离富集培养法以外，临床可以进行病原菌活菌计数的技术还有涂片镜检与(免疫)荧光成像技术。涂片镜检是细菌、真菌检查的最经典方法，其操作简单、快速，可根据高倍物镜下视野内的细菌个数来判断尿液样本中细菌的浓度。一般每高倍镜视野下细菌数量达到15
‑
20个，则对应该段尿液在培养法下的菌落数大于105CFU/mL。但该方法诊断的敏感度和特异度因人而异，十分依赖于实验人员的操作手法与经验，因此在临床中并不被推荐使用。荧光成像计数方法指的是通过荧光活性染料与细菌表面抗体结合，将具有代谢活性的细菌标记上荧光分子，最后通过荧光显微镜直接统计细菌涂片的荧光信号数量。这种免培养的检测方法大大提升了活菌计数的灵敏度与特异度，缩短了检测时间。但由于自发荧光与荧光信号不稳定，容易发生荧光猝灭的现象，这种方法的稳定性与计数准确度仍具有较大的局限。
[0004]单细胞拉曼光谱技术指的是通过共聚焦拉曼光谱仪对微区内的单细胞样品进行拉曼光谱采集与分析的技术，可以获得该单细胞样品的自发拉曼光谱指纹信息，进而可以定性、定量地分析单细胞样品在不同实验条件下的分子成分变化。
[0005]传统的拉曼光谱结合重水标记的方法虽然可以较快地确定检测样本中的病原活菌数量，然而，由于细菌会在重水标记时进行生长，导致细菌数量上升，因此该方法无法还原原始尿液样本中的活菌数量。根据实验经验，我们在使用单细胞拉曼光谱技术检测病原微生物的代谢活性时，会使用重水(D2O)等含有稳定同位素的培养基对微生物进行培养，培养时间一般最少为2小时，代谢活性的细菌会在其光谱静默区出现较为明显的“碳—氘”波段信号(1970
‑
2370cm
‑1)，参照图4。而根据细菌的生长曲线特性，一般培养的细菌在2小时内数量往往会产生数量级的改变。因此，在使用拉曼光谱仪判断细菌单细胞活性时，这样的数量变化往往会影响医生对样本中病原活菌原始浓度的判断，进而会影响对尿路感染程度的判断。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种利用拉曼光谱的病原活菌快速计数方法及系统。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种利用拉曼光谱的病原活菌快速计数方法，包括以下步骤：
[0008]S1、制备培养基，所述培养基中包括培养基母液、标记物以及生长抑制剂；
[0009]所述标记物参与病原菌代谢并使病原活菌具有拉曼特征峰，从而根据该拉曼特征峰能够判断病原菌活性；所述生长抑制剂为对病原菌的生长具有抑制作用，且所述生长抑制剂不影响所述标记物参与病原菌代谢；
[0010]S2、利用步骤S1制备的培养基对待测样本进行培养；
[0011]S3、对经步骤S2培养后的待测样本进行拉曼光谱采集，并根据拉曼特征峰识别病原活菌；
[0012]S4、根据步骤s3的结果对病原活菌进行计数。
[0013]优选的是，所述生长抑制剂为醋酸钠、乳酸钠以及柠檬酸钠中的一种或多种。
[0014]优选的是，所述生长抑制剂为醋酸钠，且所述培养基中醋酸钠的浓度为64
‑
1024mM。
[0015]优选的是，所述标记物为重水，其在所述培养基中的质量浓度为20
‑
80％。
[0016]优选的是，重水参与病原菌代谢并使病原活菌具有碳—氘拉曼特征峰，位置为1970
‑
2370cm
‑1。
[0017]优选的是，所述步骤S1中制备的培养基包括：灭菌后重水、灭菌后的醋酸钠、LB培养基母以及无菌水，其中，醋酸钠的浓度优选为128或256mM、重水的质量浓度为40％。
[0018]优选的是，所述步骤S2具体包括：将待测样本离心清洗，去除上清液后用无菌水重悬到待测样本的原始浓度，得到处理后的样本溶液，以样本溶液：培养基的体积比为K的比例，将样本溶液加入到培养基中，混合均匀后在37℃下培养2小时。
[0019]优选的是，所述步骤S3具体包括：
[0020]使用移液枪将体积为V1的经培养后得到的样本点样到镀铝载玻片表面，室温干燥后在共聚焦拉曼光谱仪下进行拉曼光谱采集，计算具有碳—氘拉曼特征峰的所有病原活菌的数量，记为n；
[0021]所述步骤S4中按照以下公式计算得到原待测样本中的病原活菌数量N：
[0022][0023]其中，V0为步骤S2中所取的待测样本的体积。
[0024]优选的是，所述步骤S2中待测样本的体积V0＝1mL；样本溶液：培养基的体积比为K为1:10；
[0025]所述步骤S3具体包括：
[0026]使用移液枪将体积为0.2μL的经培养后得到的样本点样到镀铝载玻片表面，室温干燥后在共聚焦拉曼光谱仪下以7mW、1s的激光参数进行拉曼光谱采集，计算具有碳—氘拉曼特征峰的所有病原活菌的数量，记为n；
[0027]所述步骤S4中按照以下公式计算得到原待测样本中的病原活菌数量N：
[0028][0029]优选的是，所述步骤S3具体包括：
[0030]使用移液枪将体积为V1的经培养后得到的样本点样到镀铝载玻片表面，室温干燥后在共聚焦拉曼光谱仪下进行拉曼光谱采集；
[0031]所述步骤S4中通过图像识别算法计算得到原待测样本中的病原活菌数量，具体方法为：
[0032]1)对点样区域的显微图像进行采集，并通过病原活菌的图像识别算法筛选到符合细菌形貌特征的显微图形，并对该显微图形进行病原活菌计数，从而获得点样体积内所有病原活菌数量，记为M；
[0033]2)计算点样区域的面积，记为A；
[0034]以显微图像中的点样区域视野中心为参考点，在该参考点上、下、左、右方向随机选择x个面积均为a的代表性区域使用图像识别算法识别代表性区域内的所有病原活菌，并计算得到平均病原活菌数量，记为M
’
；通过拉曼光谱对x个代表性区域内部的具有碳—本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用拉曼光谱的病原活菌快速计数方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、制备培养基，所述培养基中包括培养基母液、标记物以及生长抑制剂；所述标记物参与病原菌代谢并使病原活菌具有拉曼特征峰，从而根据该拉曼特征峰能够判断病原菌活性；所述生长抑制剂为对病原菌的生长具有抑制作用，且所述生长抑制剂不影响所述标记物参与病原菌代谢；S2、利用步骤S1制备的培养基对待测样本进行培养；S3、对经步骤S2培养后的待测样本进行拉曼光谱采集，并根据拉曼特征峰识别病原活菌；S4、根据步骤S3的结果对病原活菌进行计数。2.根据权利要求1所述的利用拉曼光谱的病原活菌快速计数方法，其特征在于，所述生长抑制剂为醋酸钠、乳酸钠以及柠檬酸钠中的一种或多种。3.根据权利要求2所述的利用拉曼光谱的病原活菌快速计数方法，其特征在于，所述生长抑制剂为醋酸钠，且所述培养基中醋酸钠的浓度为64
‑
1024mM。4.根据权利要求3所述的利用拉曼光谱的病原活菌快速计数方法，其特征在于，所述标记物为重水，其在所述培养基中的质量浓度为20
‑
80％。5.根据权利要求4所述的利用拉曼光谱的病原活菌快速计数方法，其特征在于，重水参与病原菌代谢并使病原活菌具有碳—氘拉曼特征峰，位置为1970
‑
2370cm
‑1。6.根据权利要求4所述的利用拉曼光谱的病原活菌快速计数方法，其特征在于，所述步骤S1中制备的培养基包括：灭菌后重水、灭菌后的醋酸钠、LB培养基母以及无菌水，其中，醋酸钠的浓度为128或256mM、重水的质量浓度为40％。7.根据权利要求6所述的利用拉曼光谱的病原活菌快速计数方法，其特征在于，所述步骤S2具体包括：将待测样本离心清洗，去除上清液后用无菌水重悬到待测样本的原始浓度，得到处理后的样本溶液，以样本溶液：培养基的体积比为K的比例，将样本溶液加入到培养基中，混合均匀后在37℃下培养2小时。8.根据权利要求7所述的利用拉曼光谱的病原活菌快速计数方法，其特征在于，所述步骤S3具体包括：使用移液枪将体积为V1的经培养后得到的样本点样到镀铝载玻片表面，室温干燥后在共聚焦拉曼光谱仪下进行拉曼光谱采集，计算具有碳—氘拉曼特征峰的所有病原活菌的数量，记为n；所述步骤S4中按照以下公式计算得到原待测样本中的病原活菌数量N：其中，V0为步骤S2中所取的待测样本的体积。9.根据权利要求8所述的利用拉曼光谱的病原活菌快速计数方法，其特征在于，所述步骤S2中待测样本的体...

【专利技术属性】
技术研发人员：王敬开，宋一之，郭琛，孔康，银光耀，蒙思宇，
申请(专利权)人：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，
类型：发明
国别省市：