一种新疆出血热病毒免疫层析快速检测试纸制造技术

本发明专利技术提供了一种新疆出血热病毒免疫层析快速检测试纸。本发明专利技术的一种新疆出血热病毒免疫层析快速检测试纸包括支撑固定粘衬层，在所述支撑固定粘衬层上依次交叠粘附有样品吸附层、金标结合垫、纤维素膜层和吸水材料层，在所述纤维素膜层上印制新疆出血热病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体作为检测印迹带。该新疆出血热病毒免疫层析快速检测试纸的纤维素膜层上印制羊抗鼠ＩｇＧ抗体溶液作为对照印迹带。该检测试纸的金标结合垫上吸附有胶体金标记的新疆出血热病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体。本发明专利技术的一种新疆出血热病毒免疫层析快速检测试纸有效快速检测新疆出血热病毒。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及免疫学检测方法，特别涉及一种新疆出血热病毒免g析快速检测 试纸。
技术介绍
克里米亚-刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus ， CCHFV) 是经蜱传播的虫媒病毒，属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)内罗病毒属 (Nairovirus) 。 CCHFV的基因组为分节段、单股、负链RNA,由小(S)、中(M)、 大(L) 3个节,ii且成，分别编码核蛋白(NP)、糖蛋白(GP)及RNA聚合酶(RNA-d印endent polymerase) 。 CCHFV引起的克里米亚-刚果出血热(CCHF)是一种流行于中国新疆 南部、俄国北部、中东、南部欧亚大陆及非洲撒哈拉地区的烈性传染性疾病，其平 均病死率在IO %~50 %。中国的CCHF于1965年首次-珍断于南部新疆，后在北疆 地区亦查出抗体，故称新疆出血热(XHF)。CCHFV NP抗原位点亦呈线性分布且性质稳定，是病毒诱导机体产生早期体液 免疫和细胞免疫的主要抗原，这是利用NP进行抗^f企测的理论基5出。CCHFV的检测技术主要包括病毒的分离与鉴定、血清学检查和分子生物学枱训。病毒分离要求的生物安全级别高，需在生物安全三级实验室操作；血清学检测主要^Jf]反向间接血凝抑制^r验(RPHI)、酶联免疫法(ELISA)、免疫焚光(IFA)等技^M企测CCHF患者的IgG和IgM抗体；分子生物学主要纟全测CCHFV的核酸，其才斜乍需要专业的技术人员和PCR仪以及荧光定量PCR仪等仪器。目前，临床诊断技术的JL^向为简便决捷，操作简单，不需要特定仪器设备 辅助在短时间内即可4斜乍解读。这些技术中目前应用较广的A^^Jr析检测试纸技术，该技术与其他方法比较，优势在于检测过程中样品处理简单，不需要专门仪 器和人员培训，非专业技术人员按照说明书即可操作，并可iJki4观察结果，易于在 中小型企业、基层普及与推广应用，同时适于现场快速检测。而目前还没有将新疆 出血热病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体应用于免疫层析试纸检测新疆出血热病毒的 报道。
技术实现思路
本专利技术提供了 一种新疆出血热病毒免疫层析快速检测试纸。 为实现本专利技术的目的，采用如下的技术方案本专利技术的一种新疆出血热病毒免^析快速检测试纸，包括支撑固定粘村层， 在所述支撑固定粘衬层上依次交叠粘附有样品吸附层、金标结合垫、纤维素膜层和 吸水材料层，在所述纤维素M^上印制新疆出血热病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体作 为检测印迹带。上述新疆出血热病毒免疫层析快速检测试纸，在所述纤维素膜层上印制羊抗鼠 IgG抗体溶液作为对照印迹带。上述新疆出血热病毒免^析快速检测试纸，在所述^r标结合垫上吸附有胶体 金标记的新疆出血热病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体。本专利技术的新疆出血热病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体有中和新疆出血热病毒的 特性，其效价大于1: 625000,其检测核衣壳蛋白的线性范围为lng 20ng,检测 灵凝为lng。上述新疆出血热病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体的制备方法包括如下步骤 (1)构建表M粒将新疆出血热病毒核衣壳蛋白基因克隆到表达载体上； (2 )重组核衣壳蛋白的诱导表M其纯化；(3)将步骤(2)得到的重组核衣壳蛋白免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与小 鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合，间接ELISA筛选阳性孔杂交瘤细胞，取阳性孔杂交瘤细 胞，用有限稀释法进行克隆化，得到杂交瘤细胞抹，用阳性的杂交瘤细胞注入小鼠劇空，获小鼠腹水。上述方法进一步包括如下步骤将得到的腹水佳月ProteinG柱纯化，得到核 衣壳蛋白的单克隆抗体。上述方法步骤(1)中的核衣壳蛋白基因为GenBank登录号为NC—005302的核 苷酉錄列中的S基因。表达载体为pET30a (+)载体。上述方法步骤(2)中的诱导表达采用IPTG诱导表达，纯化采用Ni柱纯化。本专利技术建立了 一种新疆出血热病毒免^析快速检测试纸，与^y亍性出血热无交X^应，可检测0. 07mg/ml的NP蛋白，有效快速检测新疆出血热病毒。 附图说明图1为新疆出血热NP蛋白在大肠杆菌BL21 (DE3)中的诱导表达的SDS-PAGE电泳的一个优选实施例的结果图2为重组NP蛋白的纯化的SDS-PAGE电泳的一个优选实施例的结果图3为单克隆抗体与重组NP蛋白的Western blot分析的一个优选实施例的结果图4为胶体金检测卡的特异性试验的一个优选实施例的结果图； 图5为胶体金检测卡的灵壽tl"^险的一个优选实施例的结果图； 图6为媒介才對以样品的免疫胶体金检测的一个优选实施例的结果图。胁实施方式为使本专利技术更加容易理解，下面结合务沐实施例，进一步阐述^^专利技术。应理解， 这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围，下列实施例中未^^及的 M实-睑方法，通常4安照常^见实-睑方法i^f亍。实施例一新疆出血热病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体的制备 (1)构建^#斤疆出血热病毒核衣壳蛋白基因的重《贈粒5根据CCHFV毒抹(GenBank登录号NC—005302 )核芬酸序列合成全长的1458bp S 基因片^殳，基因的5'端和3'分别添加BamHl和XhoI酶切位点。将该片段克隆到 同样酶切回收的pET30a (+)载体上，获得重《ibt粒pENP。 (2 )重组核衣壳蛋白的诱导表ii^其纯化将重纟赠粒pENP转化BL21 (DE3)感受态细i包，才4^单菌落于5ml的LB培养基 (25g/ml的卡那霉素抗性)，37。C培养到OD600约为0. 6左右，加入IPTG使终浓度 到lmmol/L， 25。C诱导培养3h,收集菌体，处理样品经SDS-PAGE电泳分析，观察 重组蛋白的表达情况。图1中第一泳道至第三泳道分别为蛋白质分子量标准、诱导 前后的大肠杆菌和诱导后的大肠杆菌的电泳条带，结果图显示重组E.coli BL21(pENP)诱导3h后出现一条大小约59kDa蛋白条带，与预期大小一致，这表明 CCHFV的NP蛋白在BL21 (DE3)中获得了较好表达。对重组蛋白进行可溶l"生分析，取lml诱导液离心，沉淀重悬于500^ilPBS緩冲 液，并冰浴超声波(功率为400W,超声2s，间隔6s,共15个循环)裂解菌液。离 心，保留上清，沉淀重悬于500ji的ddH20。取等体积的上清和沉淀进行SDS-PAGE, 分析目的重组蛋白的可溶性情况。将含有可溶性目的蛋白的上清和含有不可溶蛋白 的沉淀进行SDS-PAGE分析，图1中第四泳道和第五泳道分别为超声波破碎后的上 清^J1声波破碎后的沉淀电泳条带，结果显示重组蛋白在上清和沉淀中均有诱导条 带，但主要以不可溶的包涵^在。对重组NP蛋白的包涵体进行纯化和复性。诱导表达的重组菌林离心收集菌体， 每7. 7g沉淀中加入77ml PBS重悬并置冰浴中超声波裂解，离心，2. 5g沉淀用8M 尿素(50mMTris.Cl， 200mMNaCl， p朋.O)溶解，上Ni柱，25mM咪唑(50mMTris. Cl, 200mMNaCl， 8M尿素，pH8. 0)沖洗去除杂蛋白，250mM咪哇(50mM Tris. Cl， 200mM NaCl， 8M尿素，pH8. 0h规目的4元原蛋白。2mH舰液用2M尿素本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新疆出血热病毒免疫层析快速检测试纸，包括支撑固定粘衬层，在所述支撑固定粘衬层上依次交叠粘附有样品吸附层、金标结合垫、纤维素膜层和吸水材料层，其特征在于：在所述纤维素膜层上印制新疆出血热病毒核衣壳蛋白的单克隆抗体作为检测印迹带。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：相大鹏，师永霞，黄吉城，郑夔，洪烨，李小波，幸芦琴，郭波旋，钟玉清，
申请(专利权)人：广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]