本发明专利技术公开了一种浸润性乳腺癌复发风险评估试剂盒。该试剂盒是一种免疫组化试剂盒，所述试剂盒包含Ｃｙｃｌｉｎ Ａ２单克隆抗体。所述试剂盒还包含ＨＲＰ标记羊抗兔／小鼠ＩｇＧ多聚体、山羊血清、聚合物辅助剂、增敏二氨基联苯胺显色试剂盒、苏木精。用本发明专利技术的浸润性乳腺癌复发风险评估试剂盒评估浸润性乳腺癌复发风险是将乳腺组织制成石蜡切片，可以精确观察到不同区域细胞的表达量，结果更可靠。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及浸润性乳腺癌复发风险评估试剂盒。
技术介绍
大量研究发现，正常乳腺组织中存在着极少量的雌激素受体(Estrogen rec印tor:ER)和孕激素受体(Progesterone rec印tor;PR)，它们是具有高度亲和 力的蛋白质。临床上通过对雌激素受体(ER)和孕激素受体(PR)的检测，得出肿瘤 细胞内激素受体含量的水平，从而提示乳腺癌的预后信息和指导内分泌治疗。据报道 乳腺癌ER、 PR检测的阳性率分别为40% 60%、 30%左右。许多文献均已证实，ER、 PR 变化与乳腺癌病人预后密切相关，亦与其他公认的预后因素，如核分级、淋巴结转移 及分期有关。Her-2，人表皮生长因子受体-2，是一种受体型的酪氨酸激酶。在20%-30%的乳腺 癌中具有Her-2受体的过度表达。Her-2过度表达细胞表面的Her2蛋白水平较周围正 常乳腺上皮细胞高出数十倍乃至数百倍。Her2是乳腺癌的预后因子，它的阳性状态与 乳腺癌预后差相关。但是Her-2阳性乳腺癌患者只占25 30%;而50 60%Her-2阴性 的患者是否能找到另外的分子标志，还有待研究。随着基因检测研究越来越多，更多的生物标志被作为预测乳腺癌复发风险的指 标。在临床实际工作中，所用的方法尚不足以覆盖所有乳腺癌的风险评估，甚至不同 的方法得到的结果之间也有出入，所以仍有必要寻找新的有价值的肿瘤标志物，不仅 仅是为了诊断和预测复发风险，同时也可作为判断治疗敏感性的标志，甚至成为进一 步研发药物的新靶点。在哺乳动物细胞中已发现了 A-I共12型周期蛋白(cyclin)，它们在细胞周期 的不同时相发挥作用。在Gl期发挥调控作用以cyclin D、 C、 E为代表，在M期则主 要是cyclinA和B， cyclin A也作用于S期，而且即与CDK2结合也作用于CDK1，所 以cyclin A2成为cyclins家族中的重要一员。目前对cyclin A2研究认为在受到各 种刺激后可使细胞进入S期，当进入细胞周期后16个小时开始升高，24小时开始下 降，维持时间短，cyclin A2与细胞癌变关系十分密切。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种浸润性乳腺癌复发风险评估试剂盒。cyclin A2在乳腺癌组织和正常乳腺组织中的表达完全不同，在乳腺癌内部也因细胞的恶性程度不同而完全不同，其精确的程度提供了判断乳腺癌分子特征的又一有 价值的指标。Cyclin A2单克隆抗体可用来制备浸润性乳腺癌复发风险评估试剂盒。本专利技术所提供的浸润性乳腺癌复发风险评估试剂盒，是免疫组化试剂盒，所述试 剂盒包含Cyclin A2单克隆抗体。本专利技术的浸润性乳腺癌复发风险评估试剂盒为二抗试剂盒，其中一抗为Cyclin A2单克隆抗体，二抗可为辣根过氧化物酶、生物素或胶体金等标记的IgG;所述试剂 盒还包括进行免疫组化实验所需要的其他试剂，如封闭液，显色液及其他辅剂。 一抗、 二抗、封闭液，显色液及其他辅剂均可从商业途径获得。本专利技术的试剂盒还包含山羊血清，山羊血清作为封闭液。所述试剂盒还包含聚合 物辅助剂。本专利技术的试剂盒还包含HRP标记羊抗兔/小鼠IgG多聚体，HRP标记羊抗兔 /小鼠IgG多聚体作为二抗。所述试剂盒还包含增敏二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒， 本专利技术的二抗使用辣根过氧化物酶标记的，因此用增敏二氨基联苯胺显色。所述试剂 盒还可包含苏木精。用本专利技术的浸润性乳腺癌复发风险评估试剂盒评估浸润性乳腺癌复发风险， cyclin A2抗体的使用浓度是1: 20的浓度，阳性的表达范围是5 80%，说明cyclin A2的精确表达和分布，并没有因抗体的浓度而影响结果。cyclin A2和Her2的Kapar 分析没有相关性，说明两个指标把不同的患者分成了不同的层次，cyclin A2是另一 个非常好的判断预后的指标。用本专利技术的浸润性乳腺癌复发风险评估试剂盒评估浸润 性乳腺癌复发风险是将乳腺组织制成石蜡切片，可以精确观察到不同区域细胞的表达 量，结果更可靠。 附图说明图1为cyclin A2的Kaplan-Meier生存曲线。 图2为Her2的Kaplan-Meier生存曲线。 图3为显微镜下观察免疫组化(HE)染色结果。 具体实施例方式实施例1、用浸润性乳腺癌复发风险评估试剂盒评估浸润性乳腺癌复发风险 一、cyclin A2作为预测乳腺癌复发风险的分子标志 1)基因芯片分析从北京大学第三医院自2003年建立的乳腺癌组织标本库中选出6例3年内复发 的浸润性乳腺癌患者的组织标本为复发组，再选择6例病理类型、治疗方法和流行病 学特征均相同但3年以上未复发的同类患者为未复发组，另5例为进行良性乳腺病手 术时取的正常乳腺组织为正常对照组，标本进行如下处理①采集的组织块在5分钟 内放入液氮，②为确保采集的是肿瘤组织，对每一例组织进行细胞切片HE染色，并记录，以95%以上为肿瘤细胞的组织块进行基因芯片分析。Trizol法分别提取上述组织块的总RNA，其中5例正常乳腺组织的RNA相同比例 混合作为对照。总RNA分别用反转录试剂盒反转录合成cDNA。以两种荧光Cy5-dCTP和 Cy3-dCTP标记总RNA，与22k的人表达谱基因芯片(由北京博奥生物芯片有限公司合 成)杂交，用LuxScan 10KA双通道激光扫描仪(CapitalBio公司)进行扫描，用 LuxScan3. 0图像分析软件(CapitalBio公司)对芯片图像进行分析，把图像信号转 化为数字信号；然后用Lowess方法对芯片上的数据进行归一化；以SAM (Significance Analysis of Microarrays)软件进行分析，FDR控制在5%以内，以1. 5标准筛选差异 表达基因(differentially expressed genes)，同时用Cluster 3.0软件进行聚类 分析，比正常乳腺组织高出1.5倍为高表达，将高表达的做成聚类图。分别分析复发 组和未复发组高表达基因和低表达基因的差异，并通过博奥生物网提供的gene analysis database查找功能基因和相关的癌症进展。基因芯片分析结果表明，在高复发组筛选出82个上调的差异表达基因，92个下 调基因，CCNA2 (cyclin A2)在11例(l例未出结果)乳腺癌患者中均比正常组基 因表达水平高，平均增殖比率为正常组织的3. 13倍，复发和未复发患者的平均增殖比 率分别为3. 69比2. 74。2) RT-PCR步骤l)中提取的总RNA为模板，5例正常乳腺组织的RNA相同比例混合作为对 照，用引物PI和P2进行RT-PCR检测cyclin A2的表达水平。引物P1和P2由Invitrogen公司合成，引物PI和P2的核苷酸序列为 CAGGCTGCTGATGCAGAAAG; GAACAGACCAACCTGGCATTA 。lu 1 (0.3-0.5 g) 2.5 10.5ul (lOmM) 0. 5ul (lOuM) 0. 5n 1 (lOuM) 0. 5u 1 (lOU/ul) 补加无核酸酶的 H20至lj 25 u 195°C 30s， 58°C 30s， 72°C 30s, 35个循 环；72°C lOmin 。步骤l)本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种免疫组化试剂盒，该试剂盒包含Ｃｙｃｌｉｎ Ａ２单克隆抗体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李惠平，季加孚，侯宽永，雷玉涛，
申请(专利权)人：北京大学第三医院，李惠平，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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