杆状病毒表达载体制造技术

本发明专利技术涉及用于在启动子控制下重组表达口蹄疫病毒(FMDV)衣壳前体蛋白的杆状病毒表达载体，所述表达载体包含编码所述FMDV衣壳前体蛋白的核酸序列，其中核酸序列5

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】杆状病毒表达载体
[0001]本专利技术涉及用于在启动子控制下重组表达口蹄疫病毒(FMDV)衣壳前体蛋白的杆状病毒表达载体，所述表达载体包含编码FMDV衣壳前体蛋白的核酸序列。本专利技术进一步涉及一种包含所述杆状病毒表达载体的宿主细胞，一种产生FMDV病毒样颗粒(VLP)的方法，和一种产生疫苗的方法。
[0002]专利技术背景
[0003]口蹄疫(foot
‑
and
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mouth disease，FMD)是偶蹄类(cloven
‑
hoofed)、驯养和野生动物的一种高度传染性的急性病毒性疾病。它被联合国粮食及农业组织(FAO)列为跨境动物疾病。它也是一种应通报的疾病。口蹄疫在非洲、南美洲、中东和亚洲的大部分地区流行，是全球范围内经济上最重要的牲畜传染病，影响到牛、猪、绵羊、山羊和其他偶蹄类动物(artiodactyl species)，如水牛和鹿。FMD曾在世界范围内分布，但在包括北美和西欧在内的一些地区已被根除。在流行国家，FMD对国际牲畜贸易造成了经济限制，除非采取严格的预防措施，否则可以很容易地被重新引入无病区域。FMD影响了整个畜牧业，造成当地农民收入的损失。
[0004]目前的疫苗是由灭活的病毒制成的。在病毒被灭活之前，活的FMD病毒是在高密封设施中产生的，这限制了FMD疫苗的产生。有效的抗FMD疫苗接种需要完整的FMDV衣壳的存在，而不是已经被证明免疫原性不足的衣壳结构单元(Doel和Chong，1982，Archives of Virology)。灭活的FMD病毒是脆性结构，其在酸性pH或升高的温度下容易在衣壳结构单元中解体。因此，需要冷链将有效的FMD疫苗递送给家畜饲养者。
[0005]需要一种用于商业FMD疫苗的新疫苗技术，其可克服目前灭活病毒疫苗的许多缺点。
[0006]目前认为病毒样颗粒(VLP)技术是少数几种有可能成为常规灭活疫苗的可行替代品的技术之一。与现有技术相比，VLP技术的益处是，例如，产品稳定性更高，生产地点更灵活(低密封性生产)，以及对新毒株爆发的反应更快。基于VLP的疫苗通常被设计为标记疫苗，其减轻了实施产生步骤以除去非结构蛋白的必要性。
[0007]FMDV基因组编码一个单一的开放阅读框(ORF)，其产生被加工成12个成熟病毒蛋白的前体多聚蛋白，图1A(来自：Balinda等，Virology Journal 2010,7:199)。P1多聚蛋白中间体由四个衣壳结构蛋白VP1
‑
VP4组成，它们位于紧邻2A蛋白的上游，在翻译过程中引起P1和P2多聚蛋白的非蛋白水解分离，从P2释放P1
‑
2A。P1
‑
2A多聚蛋白随后被FMDV3C蛋白酶加工成2A、VP0(也被称为1AB)、VP3(1C)和VP1(1D)。VP0蛋白在封装过程中分离成VP4和VP2。FMDV病毒体由加工的病毒结构蛋白通过自组装形成。
[0008]用于基于VLP的疫苗的VLP可通过在合适的宿主细胞中重组表达FMDV前体蛋白来产生，类似于FMDV病毒体的自组装。FMDV VLP同样由加工的病毒结构蛋白通过自组装形成。
[0009]VLP的热稳定性和对低pH的敏感性可以通过在衣壳蛋白之间引入共价连接(例如半胱氨酸桥)或通过引入其它合理设计的突变来改善(Porta等(2013)PLoS Pathog)。
[0010]因为每毫升细胞培养物中FMDV VLP的初始产量通常很低，即使当使用常见的成功表达系统时，也需要提高表达水平以使基于VLP的FMD疫苗成为目前市场上经典FMD疫苗的
物有所值的替代品。因此，对杆状病毒表达载体进行了优化，以提高VLP的产量，并实现在抗原产量方面至少等于或者甚至优于常规FMD疫苗生产工艺的大规模生产工艺。
[0011]杆状病毒表达载体平台目前被用作产生VLP的优选平台之一。然而，由杆状病毒表达平台提供的相对低表达水平的FMDV VLP限制了基于VLP的FMD疫苗的开发。

技术实现思路

[0012]在本专利技术中，已经令人惊讶地发现，通过优化编码FMDV衣壳前体蛋白的开放阅读框(ORF)起始密码子之前的核酸起始序列可以增强FMDV衣壳前体蛋白经由杆状病毒表达系统的表达。令人惊讶地显示，如果起始序列在
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4至
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1位具有核酸序列5
’‑
AAAT
‑3’
，与本领域中使用的杆状病毒表达系统相比，表达产量可以得到提高。
[0013]因此，在第一方面本专利技术提供了能够在启动子控制下重组表达口蹄疫病毒(FMDV)衣壳前体蛋白的杆状病毒表达载体，所述表达载体包含编码FMDV衣壳前体蛋白的核酸序列，其中核酸序列5
’‑
AAAT
‑3’
在编码FMDV衣壳前体蛋白的开放阅读框的ATG起始密码子之前的
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4至
‑
1位。
[0014]在本专利技术的第二个方面，提供了包含本专利技术杆状病毒表达载体的宿主细胞。这种宿主细胞可用于体外组织培养中，所述宿主细胞通常是永生化细胞。
[0015]在第三方面，本专利技术提供了一种产生FMDV衣壳前体蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：用本文所述的杆状病毒表达载体感染宿主细胞，和收获由宿主细胞产生的FMDV衣壳前体蛋白。
[0016]本专利技术进一步提供了一种产生FMDV VLP的方法，所述方法包括以下步骤：用本文所述的杆状病毒表达载体感染宿主细胞，其中所述表达载体进一步包含编码能够将衣壳前体蛋白切割成一种或多种衣壳蛋白以组装成VLP的蛋白酶的核酸序列，和收获由宿主细胞产生的VLP。
[0017]本专利技术进一步涉及杆状病毒表达载体用于重组表达FMDV衣壳前体蛋白的用途。
[0018]本专利技术进一步涉及一种通过产生FMDV VLP和通过添加药学上可接受的载体将FMDV VLP掺入疫苗来产生疫苗的方法。
[0019]本专利技术进一步涉及一种通过以下来保护受试者免受FMDV感染的方法：通过在宿主细胞中从本专利技术所述的杆状病毒表达载体表达的FMDV衣壳前体蛋白以产生VLP，通过添加药学上可接受的载体将VLP掺入疫苗中，和将VLP施用于受试者。
[0020]本专利技术进一步涉及根据本专利技术第一方面的杆状病毒表达载体在保护受试者免受FMDV感染中的用途。
[0021]本专利技术进一步涉及本文所述的杆状病毒表达载体在制备用于保护受试者免受FMDV感染的药物中的用途。
具体实施方式
[0022]术语的定义
[0023]术语“核酸序列”包括RNA或DNA序列。它可以是单链或双链的。它可以是，例如，基因组的、重组的、mRNA或cDNA。
[0024]本文的术语“起始序列”是指编码FMDV衣壳前体蛋白的开放阅读框(ORF)的ATG起
始密码子的直接邻近上游(即5
’
方向)的核酸序列。与常规命名法一致，所述ATG起始密码子的“A”核苷酸被列举为“+1”。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于在启动子控制下重组表达口蹄疫病毒(FMDV)衣壳前体蛋白的杆状病毒表达载体，所述表达载体包含编码所述FMDV衣壳前体蛋白的核酸序列，其中核酸序列5
’‑
AAAT
‑3’
在编码所述FMDV衣壳前体蛋白的开放阅读框的ATG起始密码子之前的
‑
4至
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1位。2.根据权利要求1所述的杆状病毒表达载体，所述载体进一步在
‑
4至
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1位的所述核酸序列5
’‑
AAAT
‑3’
和所述启动子之间包含一个或多个用于多种限制酶的切割的限制性位点。3.根据前述权利要求中任一项所述的杆状病毒表达载体，其在
‑
11至
‑
1位具有核酸序列5
’‑
GGTAACCAAAT
‑3’
(SEQ ID NO.1)。4.根据前述权利要求中任一项所述的杆状病毒表达载体，其中在杆状病毒多角体蛋白启动子(polh)或p10启动子的控制下实现所述FMDV衣壳前体蛋白的表达。5.根据前述权利要求中任一项所述的杆状病毒表达载体，其中所述FMDV是Asia1血清型的。6.根据权利要求1
‑
4中任一项所述的杆状病毒表达载体，其中所述FMDV是SAT2血清型的。7.根据前述权利要求中任一项所述的杆状病毒表达载体，其中所述衣壳前体蛋白包含衣壳前体P1。8.根据前述权利要求中任一项所述的杆状病毒表达载体，所述载体进一步包含编码能够将所述衣壳前体蛋白切割成一种或多种衣壳蛋白的蛋白酶的核酸序列。9.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：E，
申请(专利权)人：英特维特国际股份有限公司，
类型：发明
国别省市：