一种双特异性探针-连接体复合物及其制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种双特异性探针

【技术实现步骤摘要】
一种双特异性探针
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连接体复合物及其制备方法和用途


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种双特异性探针
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连接体复合物及其制备和用途。

技术介绍

[0002]癌症是全球第二大死亡原因，恶性肿瘤细胞具有无限制生长、高浸润性和易转移的特性。手术、放疗、化疗可以杀灭肿瘤细胞，但是在没有对患者身体进行体质调节和免疫调节的情况下，并不能改变肿瘤细胞的生存环境和阻止新的肿瘤细胞不断产生，癌症就会易复发和转移。
[0003]利用人类免疫系统攻击肿瘤细胞的免疫疗法是治疗多种癌症的最新突破之一。在癌症的免疫治疗过程中，细胞毒性T淋巴细胞发挥着重要作用。通过利用抗原提呈细胞表面的主要组织相容性复合体(MHC)分子进行精确的抗原提呈，T细胞能够特异性识别肿瘤细胞表面的抗原并被激活，从而实现对肿瘤细胞的精准杀伤。为了避免复杂的抗原提呈过程，并充分利用T细胞的抗肿瘤特性，过继性T细胞免疫疗法被开发出来。其中，CAR
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T疗法通过高特异性靶向癌细胞并激活T细胞而具有良好的临床治疗效果。然而，目前的过继性T细胞免疫疗法需要针对不同患者量身定制个体化治疗，所涉及的细胞工程复杂、耗时长且花费高，还可能导致严重的细胞因子释放综合征(CRS)和神经毒性，阻碍其临床应用。此外，肿瘤细胞通过进化，获得了多种逃避人体免疫系统免疫监视和减少T细胞毒性因子释放的机制，导致患者即使接受过继性T细胞免疫疗法治疗也未能引发足够的免疫应答甚至治愈后复发。
[0004]双特异性抗体(BsAb)又称双功能抗体，具有两条抗原结合臂，其中一条抗原结合臂与靶抗原结合，另一条抗原结合臂与效应细胞上的标记抗原结合，后者可以激活效应细胞。从而，BsAb导致靶细胞与效应细胞产生直接的相互作用，使其特异性杀伤肿瘤细胞。具有明确靶向性的双特异性抗体在自然条件下并不存在，而是通过细胞融合或重组DNA技术制备实现的。目前，已有7款双特异性抗体类药物在全球上市，且仍有大量药品处于临床Ⅱ/Ⅲ期研究。大量研究证明，可利用双特异性抗体将T细胞重定向至肿瘤周围，且可通过搭配特殊的抗体削弱肿瘤细胞的免疫逃逸能力，高特异性且高效的引起患者体内免疫应答，从而精准杀灭肿瘤细胞。在无数科研人员的努力下，“双特异性抗体家族”的结构形式已经多达100多种。虽然它们的分子结构不同，但几乎所有的分子结构都可以分为两个大类别：基于片段的BsAbs和基于Fc的BsAbs。基于片段的BsAbs由两个或多个抗体片段组成，主要通过抗原结合的特性发挥相应的效应机制，具有分子量小、渗透性强、有较低的免疫原性、半衰期较短、清除速度更快这些特点，在不良反应方面可能更加具有安全优势。基于Fc的BsAbs具有同体或异二聚体Fc结构域，可以发挥Fc介导的效应功能，例如：抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用(ADCC)、补体依赖的细胞毒作用(CDC)和抗体依赖的细胞介导的细胞吞噬作用(ADCP)功能，这类双特异性抗体一般分子量较大，且易于纯化，溶解性与稳定性强，其血清半衰期相对也更长。然而，双特异性抗体的制备过程繁琐复杂，较难纯化，重链和轻链之间必须正确组装，且需在制备过程中保持其特殊的空间构象，生产成本高，很多患者难以负
担昂贵的药品费用。更严重的是，根据临床应用报道，双特异性抗体在有些患者体内引起了细胞因子释放综合征和神经毒性，严重影响药品对患者的治疗效果和患者的健康。
[0005]故目前急需一种可促进免疫治疗、低免疫原性、低副毒性和高效的肿瘤治疗药物。

技术实现思路

[0006]本专利技术的第一方面提供了一种可促进免疫治疗、低免疫原性、易合成、低副毒性和高效的双特异性探针
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连接体复合物，其包括连接体、与所述连接体共价连接的第一探针和与所述连接体共价连接的第二探针；所述第一探针的可特异性结合核仁素蛋白，所述第二探针的可特异性结合CTLA
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4。
[0007]进一步的，所述第一探针为核酸，其序列为Seq_1。
[0008]进一步的，所述第二探针为核酸，其序列为Seq_2。
[0009]进一步的，所述连接体包括与所述第一探针连接的第一连接体、与所述第二探针连接的第二连接体以及同时与所述第一连接体和所述第二连接体连接的第三连接体。
[0010]更进一步的，所述第一连接体为胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰乙醇胺或其或衍生物；和/或，所述第二连接体为胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰乙醇胺或其衍生物；和/或，所述第三连接体为脂质体纳米颗粒或细胞外囊泡。
[0011]本专利技术的第二个方面提供了一种双特异性探针
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连接体复合物的制备方法：S1.将第一连接体与第一探针共价连接，制备得第一探针
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第一连接体复合物；S2.将第二连接体与第二探针共价连接，制备得第二探针
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第二连接体复合物；S3.将所述第一探针
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第一连接体复合物、所述第二探针
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第二连接体复合物、第三连接体混合反应，制备获得所述探针
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连接体复合物；其中，所述第一探针的可特异性结合核仁素蛋白，所述第二探针的可特异性结合CTLA
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4。
[0012]更进一步的，所述第一探针为核酸，其序列为Seq_1；和/或，所述第二探针为核酸，其序列为Seq_2；和/或，所述第一连接体为胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰乙醇胺或其衍生物；和/或，所述第二连接体为胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰乙醇胺或其衍生物；和/或，所述第三连接体为脂质体纳米颗粒或胞外囊泡。
[0013]进一步的，所述第一探针与所述第二探针的
‑5’
端均修饰了第一特定基团；第一连接体、第二连接体均为胆固醇，且胆固醇也修饰了第二特定基团；第一探针或第二探针分别与胆固醇通过化学反应形成共价键连接在一起；第一特定基团与第二特定基团至少发生下述(a)至(g)中的任一反应：
[0014](a)NHS酯基基团和氨基基团的取代反应；
[0015](b)叠氮基团和二苯基环辛炔基团的点击化学反应；
[0016](c)叠氮基团和环辛炔基基团的点击化学反应；
[0017](d)叠氮基团和炔基基团的点击化学反应；
[0018](e)马来酰亚胺基基团和呋喃基团的加成反应；
[0019](f)硫代磷酸基团和氯乙酰基基团的SN2反应；
[0020](g)氨基基团和羧基基团的缩合反应。
[0021]更进一步的，所述第一探针为核酸，其序列为Seq_1，所述第一探针一端经NH2修饰；所述第二探针为核酸，其序列为Seq_2，所述第二探针一端经NH2修饰；所述第一连接体、
所述第二连接体均为经N
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羟基琥珀酰亚胺修饰的胆固醇；所述第三连接体为脂质体纳米颗粒；在所述S1中，所述第一探针与所述第一连接体的投料比为摩尔比1：(1～100)；在所述S2中，所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双特异性探针
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连接体复合物，其包括连接体、与所述连接体共价连接的第一探针和与所述连接体共价连接的第二探针；其特征在于，所述第一探针的可特异性结合核仁素蛋白，所述第二探针的可特异性结合CTLA
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4。2.根据权利要求1所述探针
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连接体复合物，其特征在于，所述第一探针为核酸，其序列为Seq_1。3.根据权利要求1所述探针
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连接体复合物，其特征在于，所述第二探针为核酸，其序列为Seq_2。4.根据权利要求1所述探针
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连接体复合物，其特征在于，所述连接体包括与所述第一探针连接的第一连接体、与所述第二探针连接的第二连接体以及同时与所述第一连接体和所述第二连接体连接的第三连接体。5.根据权利要求4所述探针
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连接体复合物，所述第一连接体为胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰乙醇胺或其或衍生物；和/或，所述第二连接体为胆固醇、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二油酰基磷脂酰乙醇胺或其衍生物；和/或，所述第三连接体为脂质体纳米颗粒或细胞外囊泡。6.一种制备双特异性探针
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连接体复合物的制备方法，特征在于，S1.将第一连接体与第一探针共价连接，制备得第一探针
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第一连接体复合物；S2.将第二连接体与第二探针共价连接，制备得第二探针
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第二连接体复合物；S3.将所述第一探针
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第一连接体复合物、所述第二探针
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第二连接体复合物、第三连接体混合反应，制备获得所述探针
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连接体复合物；其中，所述第一探针的可特异性结合核仁素蛋白，所述第二探针的可特异性结合CTLA
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4。7.根据权利要求6所述的双特异性探针
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连接体复合物的制备方法，其特征在于，所述第一探针为核酸，其序列为Seq_1；和/或，所述第二探针为核酸，其序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：王珊，任欢欢，周高雅，柴志勇，成昱昊，周恒雨，黄婧，吕品，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：