一种重组前白蛋白（PA）蛋白的制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及生物工程技术技术领域，具体涉及一种重组前白蛋白(PA)蛋白的制备方法与应用，包括将去除信号肽的PA序列亚克隆至pET22b表达载体上，得到表达质粒；将所述表达质粒转至大肠杆菌中筛选表达量最高的菌株；将所述表达量最高的菌株进行发酵，得到表达菌液；对所述表达菌液依次进行收集、裂解和目的重组蛋白的纯化，得到重组PA蛋白；测定所述重组PA蛋白的生化活性及添加稳定剂后的稳定性，测定结果，本发明专利技术利用大肠杆菌和原核表达载体pET22b表达获得重组PA蛋白，提供来源容易、产量高的方法，解决了前白蛋白原料收集困难的问题。解决了前白蛋白原料收集困难的问题。解决了前白蛋白原料收集困难的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种重组前白蛋白(PA)蛋白的制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物工程技术
，尤其涉及一种重组前白蛋白(PA)蛋白的制备方法与应用。

技术介绍

[0002]前白蛋白，又称转甲状腺素蛋白(transthyretin，TTR)，由肝脏实质细胞、大脑脉络丛、视网膜色素上皮细胞、胰岛α细胞、卵黄囊内胚层、松果体等组织或部位合成和分泌的蛋白质。是一种127个氨基酸(13.7KD)在生理条件下形成同源四聚体的血清蛋白。在全血清电泳分离时，常显示在白蛋白(Alb)的前方。
[0003]PA主要生理功能是结合并运输维生素A和甲状腺素，从而参与它们的调节。该蛋白在人体内的生物半衰期短，多数报道为1.9天，常在临床上作为一项反映肝功能损害及各种营养不良的指标，其灵敏性比白蛋白和转铁蛋白更高。大量研究证明，PA含量在肝脏疾病、肾病、急性感染及恶性肿瘤等疾病方面水平明显降低，随着近年的深入研究，总结出PA是一种急性负时相反应蛋白，在机体应激反应、坏死物质清除、组织修补等生理过程中拥有重要作用，并且在心内科疾病的诊断、危险分层、预后评估等方面具有本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种重组前白蛋白(PA)蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将去除信号肽的PA序列亚克隆至pET22b表达质粒上，得到表达质粒；将所述表达质粒转化至大肠杆菌中筛选表达量最高的菌株；将所述表达量最高的菌株进行发酵，得到表达菌液；对所述表达菌液依次进行收集、裂解和目的重组蛋白的纯化，得到重组PA蛋白；测定所述重组PA蛋白的生化活性及添加稳定剂后的稳定性，测定结果。2.如权利要求1所述的重组前白蛋白(PA)蛋白的制备方法，其特征在于，所述将所述表达质粒转化至大肠杆菌中筛选表达量最高的菌株，包括：将合成的pET22b
‑
PA表达质粒分别转化至大肠表达感受态Transetta(DE3)、TransB(DE3)、BL21(DE3)和BL21(DE3)pLySs中，涂板后挑取各阳性菌株分别接种于5ml含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃、200rpm培养至OD
600
值达到0.6
‑
0.8左右时，加入IPTG至终浓度1mmol/L，25℃、200rpm条件下摇床培养16
‑
18h，收集菌体；用300μl1
×
PBS缓冲液对所述菌体重悬后超声，12000rpm、4℃离心20分钟，将上清与沉淀分离，同时沉淀用等体积1
×
PBS缓冲液重悬，分别取各菌株的上清及沉淀进行SDS
‑
PAGE电泳检测，并用优利特前白蛋白测定试剂盒在贝克曼AU480全自动生化分析仪检测上清中活性PA重组蛋白含量，得到表达情况；所述表达情况中表达菌株TransB(DE3)表达量最高，得到表达量最高的菌株。3.如权利要求2所述的重组前白蛋白(PA)蛋白的制备方法，其特征在于，所述将所述表达量最高的菌株进行发酵，得到表达菌液，包括：将表达量最高的所述表达菌株TransB(DE3)接种于20ml含100μg/mL氨苄青霉素，15μg/mL四环素，25μg/mL硫酸卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm条件下摇床培养12h，之后将所得菌液接种于1000ml含100μg/mL氨苄青霉素，15μg/mL四环素，25μg/mL硫酸卡那霉素的LB培养基中，37℃、200rpm条件下摇床培养至OD
600
为0.6
‑
1.0之间时，加入IPTG至上述发酵菌液中，使IPTG浓度为0.1mmol/L，18℃、150rpm条件下继续摇床培养12
‑
16h，得到表达菌液。4.如权利要求3所述的重组前白蛋白(PA)蛋白的制备方法，其特征在于，所述对所述表达菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨倩，邓珍琴，李建平，
申请(专利权)人：桂林英美特生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：