一种平衡苯丙醇合成工程菌胞内还原力的方法技术

一种平衡苯丙醇合成工程菌胞内还原力的方法，包括：以使NADH再生为策略，构建合成苯丙醇的大肠杆菌，并引入异源基因甲酸脱氢酶，通过甲酸脱氢酶对甲酸钠的作用，实现辅酶NADH再生，从而提高关键酶的催化效率。本发明专利技术的方法能够强化大肠杆菌工程菌胞内还原力的平衡，提高前体苯丙酸与终产物苯丙醇产量，有利于降低生产成本。生产成本。生产成本。

【技术实现步骤摘要】
一种平衡苯丙醇合成工程菌胞内还原力的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种强化大肠杆菌还原力循环以提高苯丙醇产量的方法。

技术介绍

[0002]苯丙醇，也称为3
‑
苯基丙醇，具有清新香甜的气味，是一种天然存在于植物中的物质。可以用作香料，添加于化妆品和日用品中，也可以用作食物香料。在医药工业中可以作为前体合成松弛剂强盘松。目前苯丙醇的制备主要依赖植物提取和化学合成，考虑到植物提取法效率低，化学合成法需要重金属作为催化剂，同时需要氢气作为还原剂，不够环保节能，因此使用微生物发酵法生产苯丙酸成为一种新的选择，具有污染小、耗能少、环境友好的优点。Liu以大肠杆菌作为平台进行代谢工程改造，实现了苯丙醇在大肠杆菌中的生物合成
[1]。但苯丙醇与前体苯丙酸的合成均为NADH依赖型，反应中存在还原力不足的问题。[1]Liu et al.Microb Cell Fact(2021)20:121

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是提供一种强化大肠杆菌胞内还原力，增进合成苯丙醇的大肠杆菌工程菌胞内还原力的平衡性，进而增加苯丙醇产量的方法。
[0004]为实现上述专利技术目的，本专利技术的技术方案具体如下：
[0005]一种平衡苯丙醇合成工程菌胞内还原力的方法，其特征在于，包括：
[0006]使用大肠杆菌作为宿主菌，异源引入来自植物的酪氨酸解氨酶(TAL)和来自细菌的烯酸还原酶(ER)基因，以甘油和葡萄糖作为碳源发酵生产苯丙酸。
[0007]进一步的，包括：使用大肠杆菌作为宿主菌，合成酪氨酸解氨酶(TAL)和烯酸还原酶(ER)基因片段，通过同源重组方法将酪氨酸解氨酶(TAL)和烯酸还原酶(ER)基因分别连接到高拷贝质粒pZE12
‑
luc上，获得pZE
‑
TAL
‑
ER重组质粒；将构建好的质粒转入大肠杆菌感受态细胞中，以甘油和葡萄糖作为碳源发酵生产苯丙酸。
[0008]进一步的，在摇瓶反应器中以甘油和葡萄糖作为碳源发酵生产苯丙酸。
[0009]进一步的，所述发酵方法包括：
[0010]在摇瓶反应器加入液体培养基，高温灭菌后接入1％活化后的大肠杆菌工程菌种子液，在温度37℃条件下进行振荡培养。当OD
600
值为0.4
‑
0.6时，加入IPTG进行诱导。
[0011]进一步的，所述液体培养基成分为M9培养基。
[0012]进一步的，M9培养基的配方是：重量0.5％的酵母粉，重量1％的甘油和重量0.25％的葡萄糖，重量0.2％的甲酸钠，且pH7
‑
7.5。
[0013]与现有技术相比，本专利技术的有益技术效果：
[0014]本专利技术针对苯丙醇生产过程中，前体苯丙酸的合成与终产物苯丙醇合成均消耗NADH、从而导致胞内还原力不平衡的重点问题，提出以使NADH再生为策略，引入异源基因甲酸脱氢酶，通过甲酸脱氢酶对甲酸钠的作用，实现辅酶NADH再生，从而提高关键酶的催化效
率。通过上述技术方法，本专利技术能够强化大肠杆菌工程菌胞内还原力的平衡，提高前体苯丙酸与终产物苯丙醇产量，有利于降低生产成本。
附图说明
[0015]图1是具体实施例1中大肠杆菌代谢途径示意图与反应中还原力NADH消耗与回补的流程图。
[0016]图2是具体实施例1摇瓶反应器中大肠杆菌工程菌在引入甲酸脱氢酶后从头生产苯丙酸的情况。
[0017]图3是具体实施例2摇瓶反应器中大肠杆菌工程菌在引入甲酸脱氢酶后催化苯丙酸生产苯丙醇的情况。
[0018]图4是具体实施例3摇瓶反应器中大肠杆菌工程菌在引入甲酸脱氢酶后从头生产苯丙醇的情况。
具体实施方式：
[0019]下面将结合附图和具体实施例，对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0020]实施例1
[0021]本实施方式中强化胞内NADH平衡从而提高从头合成苯丙酸效率的培养工艺是使用摇瓶反应器，分别构建不表达甲酸脱氢酶的生产苯丙酸的大肠杆菌工程菌，与表达甲酸脱氢酶的生产苯丙酸的大肠杆菌工程菌，将其分别接入液体培养基进行发酵的应用。
[0022]如图1所示，本实施例中构建大肠杆菌工程菌具体方法为，使用大肠杆菌作为宿主菌，异源引入来自植物的酪氨酸解氨酶(TAL)和来自细菌的烯酸还原酶(ER)基因，在摇瓶反应器中以甘油和葡萄糖作为碳源发酵生产苯丙酸。具体方法为通过合成方法获得相应基因片段，通过同源重组方法将目的基因分别连接到高拷贝质粒pZE12
‑
luc上，获得pZE
‑
TAL
‑
ER重组质粒。将构建好的质粒转入大肠杆菌感受态细胞中。将该工程菌定义为EC1。同时将合成的来自细菌的FDH基因引入中拷贝质粒pCS27上，获得pCS
‑
FDH重组质粒。将构建好的质粒与pZE
‑
TAL
‑
ER共同转入大肠杆菌感受态细胞中。将该工程菌定义为EC2。
[0023]具体发酵生产苯丙酸的方法为100mL摇瓶反应器加入20mL液体培养基，高温灭菌后接入1％活化后的大肠杆菌工程菌种子液，在温度37℃条件下进行振荡培养。当OD
600
值为0.4
‑
0.6时，加入IPTG进行诱导。取样测定OD
600
值，用高效液相色谱测定苯丙酸的浓度，比较菌株EC1和EC2的生长与产量情况。
[0024]其中培养基成分为M9培养基，包含重量0.5％的酵母粉，重量1％的甘油和重量0.25％的葡萄糖，重量0.2％的甲酸钠，且pH7
‑
7.5。
[0025]附图2所示为加强胞内还原力平衡后前体苯丙酸产量的变化趋势，浅灰色柱为苯丙酸产量，浅灰色斜线柱为OD
600
值。如图2可知，与菌株EC1相比，引入甲酸脱氢酶的大肠杆菌EC2苯丙酸产量达到452.85mg/L，而没有引入甲酸脱氢酶的EC1生产了396.22mg/L苯丙酸，因此引入甲酸脱氢酶强化胞内还原力平衡有助于提高苯丙酸产量。
[0026]实施例2
[0027]本实施方式中强化胞内NADH平衡从而提高苯丙酸到苯丙醇催化效率的培养工艺是使用摇瓶反应器，分别构建不表达甲酸脱氢酶的催化苯丙酸生产苯丙醇的大肠杆菌工程菌，与表达甲酸脱氢酶的催化苯丙酸生产苯丙醇的大肠杆菌工程菌，将其分别接入液体培养基进行发酵，通过添加实验测试甲酸脱氢酶在苯丙酸生产苯丙醇过程中作用的应用。
[0028]本实施例中构建大肠杆菌工程菌具体方法为，使用大肠杆菌作为宿主菌，异源引入来来自细菌的羧酸还原酶(CAR)与其辅酶磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(SFP)基因。在摇瓶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种平衡苯丙醇合成工程菌胞内还原力的方法，其特征在于，包括：使用大肠杆菌作为宿主菌，异源引入来自植物的酪氨酸解氨酶(TAL)和来自细菌的烯酸还原酶(ER)基因，以甘油和葡萄糖作为碳源发酵生产苯丙酸。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括：使用大肠杆菌作为宿主菌，合成酪氨酸解氨酶(TAL)和烯酸还原酶(ER)基因片段，通过同源重组方法将酪氨酸解氨酶(TAL)和烯酸还原酶(ER)基因分别连接到高拷贝质粒pZE12
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luc上，获得pZE
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TAL
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ER重组质粒；将构建好的质粒转入大肠杆菌感受态细胞中，以甘油和葡萄糖作为碳源发酵生产苯丙酸。3.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙婧，
申请(专利权)人：江苏师范大学，
类型：发明
国别省市：