用于鉴定菲牛蛭的特异性引物及快速PCR方法技术

本发明专利技术公开了一种用于鉴定菲牛蛭的特异性引物，上游引物L315为：5

【技术实现步骤摘要】
用于鉴定菲牛蛭的特异性引物及快速PCR方法


[0001]本专利技术属于分子生物
更具体地说，本专利技术涉及一种用于鉴定菲牛蛭的特异性引物及快速PCR方法。

技术介绍

[0002]菲牛蛭(Poecilobdella manillensis Lesson)，俗称金边蚂蟥，隶属于环节动物门蛭纲无吻蛭目医蛭科牛蛭属,广泛分布于我国广西、广东、福建等地，是广西的特色药用动物资源，收录在2011年版《广西壮族自治区壮药质量标准》第二卷。菲牛蛭体内含有水蛭素、菲牛蛭素、纤溶酶、透明质酸酶，血小板聚集抑制剂等多种活性成分，具有抗凝血、抗血栓、抗肿瘤、抗痛风、降血脂等作用。其抗凝活性分别是日本医蛭、宽体金线蛭的3.6倍、13.2倍，可见菲牛蛭抗凝血功能优于其他几种水蛭。此外，菲牛蛭抗凝提取物中还含有多种具有潜在药用价值的蛋白质成分，具有良好的营养保健价值。
[0003]菲牛蛭具有极高的药用价值和养殖潜力，主要以人工养殖为主，然而，市场上常出现掺伪、品种混杂、加工等问题。而传统的鉴别方法中，性状鉴别方法需要鉴定者具有较高的专业水平和一定的鉴别经验，仅利用药典中的薄层色谱鉴别方法存在一定局限性，特别是对于含有菲牛蛭的中成药，菲牛蛭的性状特征消失，传统的鉴别方法则更难以满足实际工作需求。分子鉴定技术的发展为动物类中药的鉴别提供了新的技术手段，然而传统DNA分子鉴定方法，实验周期较长，也较为繁琐，在完成PCR反应后还需电泳、成像与测序等步骤，耗时较长如3～4天，严重制约了分子鉴定技术的进一步应用。快速PCR方法是在特异性PCR技术基础上的进一步发展，通过结合DNA快速提取、快速PCR扩增和荧光检测技术，可以大大缩短PCR反应时间，提高效率。目前，快速PCR方法已成功应用于蛤蚧、山药、蛤蟆油、蕲蛇等中药的真伪鉴定与质量控制中，但在鉴别菲牛蛭相关研究尚未见有报道。

技术实现思路

[0004]本专利技术的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。
[0005]本专利技术的一个目的是提供一种用于鉴定菲牛蛭的特异性引物，其能够较为快速简单且有效的菲牛蛭鉴别方法，为实现菲牛蛭分子鉴别的现场运用提供技术保障，保证菲牛蛭临床用药安全和疗效。
[0006]为了实现本专利技术的这些目的和其它优点，提供了一种用于鉴定菲牛蛭的特异性引物，上游引物L315为：5
′‑
tgttggtacaggatgaacta
‑3′
，下游引物H566为：5
′‑
gctgctgctaatactggta
‑3′
。
[0007]优选的是，特异性引物的设计包括以下步骤：
[0008]1)从NCBI数据库中下载菲牛蛭、日本医蛭、宽体金线蛭、天目山蛭的COI序列，下载的序列利用BioEdit软件进行多重序列比对，找出具有稳定差异的变异位点，选择菲牛蛭与日本医蛭、宽体金线蛭、天目山蛭差异大的区域进行引物设计；
[0009]2)使用引物设计软件Premier Primer 5.0设计特异性引物，调整参数使引物的3
’
末端位于菲牛蛭与日本医蛭、宽体金线蛭、天目山蛭的差异区域，Tm值为55～65℃，预期扩增长度为251bp，得到所述特异性引物。
[0010]一种用于鉴定菲牛蛭的PCR方法，包括上述的上游引物L315和下游引物H566。
[0011]优选的是，PCR反应体系为：Takara Premix Ex taq 12.5μL，上游引物L315、下游引物H566各1μL，并使引物终浓度为0.4μm，DNA模板1μL，加无菌双蒸水至25μL；
[0012]PCR扩增程序为：94℃预变性1min，94℃变性30s，52℃退火30s，28个循环。
[0013]优选的是，在PCR扩增产物中加入SYBR Green I于365nm紫外波长下检测荧光，产生强烈绿色荧光的为菲牛蛭。
[0014]本专利技术至少包括以下有益效果：
[0015]第一、本专利技术针对现有PCR技术在菲牛蛭鉴别应用中的不足，以菲牛蛭及其他物种在CO1序列具有稳定差异的SNP位点为基础设计了菲牛蛭的特异性引物，并利用快速PCR建立了菲牛蛭区别于其他蛭类的鉴定方法。
[0016]第二、本专利技术的创造性的结合了快速PCR技术对菲牛蛭进行鉴定，采用碱裂解法提取DNA，其较一般提取方法操作更为简便和快速，优化的PCR反应参数较一般的分子鉴定方法也耗时更短。
[0017]第三、本专利技术引入荧光染料对扩增产物进行检测，可达到快速鉴别目的。样品不需要经过测序等方法，只需根据紫外灯下荧光检测结果即可完成菲牛蛭的鉴定，也适用于快速鉴定大批量样品，较大提高了鉴别效率，解决菲牛蛭市场掺伪的问题，对于保证菲牛蛭临床用药安全和疗效、规范菲牛蛭市场秩序具有重要意义。
[0018]本专利技术的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本专利技术的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
[0019]图1为CO1通用引物PCR扩增产物电泳结果，其中，M为D2000 DNA Marker；W为空白对照；1～10为菲牛蛭(鲜品)；11～13为菲牛蛭(药材)；14～19为宽体金线蛭(药材)；20～28为宽体金线蛭(鲜品)；29～37为日本医蛭(鲜品)；38～43为天目山蛭(鲜品)；
[0020]图2为特异性引物PCR扩增产物电泳结果，其中，注：M为D2000 DNA Marker；W为空白对照；1～10为菲牛蛭(鲜品)；11～13为菲牛蛭(药材)；14～19为宽体金线蛭(药材)；20～28为宽体金线蛭(鲜品)；29～37为日本医蛭(鲜品)；38～43为天目山蛭(鲜品)；
[0021]图3为快速PCR扩增产物的荧光检测结果图。
具体实施方式
[0022]下面结合附图对本专利技术做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
[0023]应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不排除一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
[0024]需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0025]实施例1、基因组DNA提取及检测
[0026]一、溶液的配置
[0027]溶液A：用量筒量取97mL灭菌水于烧杯中，再用移液器吸取曲拉通100(纯度为98％)1mL，搅拌溶解。
[0028]溶液B：取氢氧化钠固体0.8g于一小烧杯中，加入20mL灭菌水。称取Tris
‑
HCl固体7.88g，于另一小烧杯中，先加入约40mL的灭菌水，后续少量多次加入适量的氢氧化钠溶液和灭菌水，调节至溶液的总体积为50mL，pH＝8。得到50ml 1M的Tris
‑
HCl溶液(pH＝8)，取该溶液10mL于玻璃瓶中，量筒量取90mL灭菌水，稀释得到0.1M的Tris
‑本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于鉴定菲牛蛭的特异性引物，其特征在于，上游引物L315为：5
′‑
tgttggtacaggatgaacta
‑3′
，下游引物H566为：5
′‑
gctgctgctaatactggta
‑3′
。2.根据权利要求1所述的用于鉴定菲牛蛭的特异性引物，其特征在于，特异性引物的设计包括以下步骤：1)从NCBI数据库中下载菲牛蛭、日本医蛭、宽体金线蛭、天目山蛭的COI序列，下载的序列利用BioEdit软件进行多重序列比对，找出具有稳定差异的变异位点，选择菲牛蛭与日本医蛭、宽体金线蛭、天目山蛭差异大的区域进行引物设计；2)使用引物设计软件Premier Primer 5.0设计特异性引物，调整参数使引物的3
’
末端位于菲牛...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄勇，颜琳妙，江馥利，王乙淋，李宏宇，
申请(专利权)人：广西中医药大学，
类型：发明
国别省市：