一种西藏鱼类寄生异肉吸虫的检测鉴定方法技术

本发明专利技术提供了一种西藏鱼类寄生异肉吸虫的检测鉴定方法，包括如下步骤：根据异肉吸虫属吸虫的形态特征，采集鱼类宿主中的异肉吸虫；提取虫体样本的DNA；进行琼脂糖凝胶电泳以检测所提取DNA的质量，若质量合格，则建立反应体系，进行PCR扩增；将测序结果进行序列比对，若一致性在99%以上，则判定该物种为西藏鱼类寄生的异肉吸虫。该鉴定方法具有实验快捷、操作简便、结果准确可靠的优点。结果准确可靠的优点。结果准确可靠的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种西藏鱼类寄生异肉吸虫的检测鉴定方法


[0001]本专利技术属于传统形态学与分子生物学检测相结合进行鉴定的
，具体涉及一种西藏鱼类寄生异肉吸虫的检测鉴定方法。

技术介绍

[0002]异肉吸虫隶属于吸虫纲(Trematoda)复殖目(Digenea)异肉科(Allocreadiidae)异肉吸虫属(Allocreadium)，是西藏土著鱼类常见的一种寄生虫。其幼虫寄生于鱼类宿主肠道内部。
[0003]因异肉吸虫有不同种，形态相似，故从形态方面只能依靠基本形态特征将该虫鉴定到属，目前对于异肉吸虫属的种类还未能鉴定到种。在NCBI数据库中虽然有线粒体基因数据，但在研究中发现该虫的线粒体基因并非高度保守，而是存在较大变异，故仅使用通用引物对某一线粒体基因进行测序，结果并不能准确鉴定该虫。物种无法确定，有针对性的保护和防治工作也无法顺利开展。

技术实现思路

[0004]为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种西藏鱼类寄生异肉吸虫的检测鉴定方法，能准确鉴定西藏鱼类寄生异肉吸虫的种类，该鉴定方法具有实验结果准确可靠的优点。本专利技术采用的技术方案是：一种西藏鱼类寄生异肉吸虫的检测鉴定方法，包括如下步骤：A、根据异肉吸虫属吸虫的形态特征，采集鱼类宿主中的异肉吸虫；B、提取虫体样本的DNA；C、进行琼脂糖凝胶电泳以检测所提取DNA的质量，若质量合格，则建立反应体系，进行PCR扩增；D、将测序结果进行序列比对，若一致性在99%以上，则判定该物种为西藏鱼类寄生的异肉吸虫。
[0005]本专利技术所述异肉吸虫的形态特征为：虫体较肥厚，向头尾两端延长，无棘，体白色，略透明。吸盘与咽发育良好。腹吸盘位于体前端，身体最宽处位于腹吸盘后端。肠分支，前端从腹吸盘处开始，沿睾丸两侧向下延伸至体后端。睾丸2个，椭圆形，紧挨一起，后睾大于前睾，卵巢位于腹吸盘与前睾丸之间，椭圆形，比前睾小，下方有一个大小相近的受精囊。阴茎囊位于食道与腹吸盘交汇处。卵黄腺发达，从腹吸盘前端沿体两侧一直延伸至体末端。排泄囊位于体末端。成熟虫卵椭圆形，透明或淡棕色，数量众多，密布于腹吸盘与前睾之间。
[0006]本专利技术所述虫体样本的采集方法，刮取鱼类消化道的内容物和粘液，置于玻璃板中，并用同样大小的玻璃板挤压，使内容物和粘液分散展开，采用便携式解剖镜观察虫体形态并采集样本。
[0007]本专利技术所述特异性引物为ITS转录间隔区域扩增引物，核苷酸序列为：上游引物： GCTTGCGCTGATTACGTCCC 下游引物： CACGAGCCGAGTGATCCAC。
[0008]本专利技术所述D步骤用于序列比对的碱基序列为SEQID：NO.3。
[0009]在对异肉吸虫的深入研究中发现，由于线粒体的某些基因，如12S进化速度过快，基因序列变异较大，如果仅依靠单一的线粒体基因测序，根据结果很有可能会出现将该虫不同个体鉴定为同属不同种的现象。后生动物的ITS转录间隔区域保守度较高，但NCBI数据库里没有异肉吸虫ITS基因序列的相关数据，本专利技术提供了用于ITS转录间隔区域基因测序的特异性引物，以及测序完成后可供比对的碱基序列，准确率显著高于仅靠形态或使用通用引物对某一线粒体基因测序后再比对的方法，具有实验结果准确可靠的优点，可实现对异肉吸虫精确鉴定，有助于在西藏地区开展针对性的防治工作。
附图说明
[0010]图1为使用琼脂糖凝胶电泳检测异肉吸虫的ITS转录间隔区域DNA提取质量的条带图。
具体实施方式
[0011]为了更加清楚、详细地说明本专利技术的目的技术方案，下面通过相关实施例对本专利技术进行进一步描述。以下实施例仅为具体说明本专利技术的实施方法，并不限定本专利技术的保护范围。
[0012]实施例1一种西藏鱼类寄生异肉吸虫的检测鉴定方法，包括如下步骤：A、根据异肉吸虫属吸虫的形态特征，采集鱼类宿主中的异肉吸虫；B、提取虫体样本的DNA；C、进行琼脂糖凝胶电泳以检测所提取DNA的质量，若质量合格，则建立反应体系，进行PCR扩增；D、将测序结果进行序列比对，若一致性在99%以上，则判定该物种为西藏鱼类寄生异肉吸虫。
[0013]实施例2本实施例在实施例1的基础上：所述虫体样本的采集方法，刮取鱼类消化道的内容物和粘液，置于玻璃板中，并用同样大小的玻璃板挤压，使内容物和粘液分散展开，采用便携式解剖镜观察虫体形态并采集样本。
[0014]所述玻璃板的大小为10*10cm，大小适于所使用的便携式解剖镜。
[0015]实施例3本实施例在实施例1的基础上：所述异肉吸虫的形态特征为：虫体较肥厚，向头尾两端延长，无棘，体白色，略透明。吸盘与咽发育良好。腹吸盘位于体前端，身体最宽处位于腹吸盘后端。肠分支，前端从腹吸盘处开始，沿睾丸两侧向下延伸至体后端。睾丸2个，椭圆形，紧挨一起，后睾大于前睾，卵巢位于腹吸盘与前睾丸之间，椭圆形，比前睾小，下方有一个大小相近的受精囊。阴茎囊位于食道与腹吸盘交汇处。卵黄腺发达，从腹吸盘前端沿体两侧一直延伸至体末端。排泄囊位于体末端。成熟虫卵椭圆形，透明或淡棕色，数量众多，密布于腹吸盘与前睾之间。
[0016]实施例4本实施例在实施例1的基础上：所述特异性引物为ITS转录间隔区域扩增引物，核苷酸序列为：上游引物： GCTTGCGCTGATTACGTCCC 下游引物： CACGAGCCGAGTGATCCAC。
[0017]所述D步骤用于序列比对的基因片段为SEQID：NO.3。
[0018]实施例5用剪刀剪开异齿裂腹鱼的肠道，收集齿裂腹鱼样本，根据形态特征，采集疑似异肉吸虫样本，用0.65%生理盐水清洗干净并吸干多余水分后，保存于纯酒精中。
[0019]DNA提取将虫体从纯酒精中取出，用蒸馏水冲洗干净，放入PCR管中，将多余水分吸干，使用组织细胞基因组DNA快速提取试剂盒（北京艾德莱生物科技有限公司）对组织样品进行DNA提取。提取完成后，通过凝胶电泳检测DNA质量，见图1，未发生降解，也未混有其他杂质，可进行后续实验。操作步骤严格按照试剂盒说明进行。
[0020]特异性引物设计对西藏水产研究所采集到的异肉吸虫ITS转录间隔区域进行分析，同时利用已获得的近源寄生虫，通过Clustal X 进行比对后，选择与同属其他物种存在较大区别的区域设计引物，设计的引物即为针对该可变区的特异性引物，对异肉吸虫具有高特异性。通过该引物，成功扩增出异肉吸虫的碱基序列SEQID：NO.3，用于该异肉吸虫的测序后的比对鉴定。
[0021]设计得到的ITS转录间隔区域的特异性引物为：上游引物： GCTTGCGCTGATTACGTCCC 下游引物： CACGAGCCGAGTGATCCACPCR 鉴定离心机、PCR仪、恒温水浴锅、冰箱、六一电泳仪电源、移液器（10μL，100μL，1 000μL）、吸头（10μL，100μL，1 000μL）、PCR反应管； rTaq polymerase (250 U, Takara)、ddH2O。
[0022]PCR扩增反应体系及条件的确定 反应体系总体积:本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种西藏鱼类寄生异肉吸虫的检测鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：A、根据异肉吸虫属吸虫的形态特征，采集鱼类宿主中的异肉吸虫；B、提取虫体样本的DNA；C、进行琼脂糖凝胶电泳以检测所提取DNA的质量，若质量合格，则建立反应体系，进行PCR扩增；D、将测序结果进行序列比对，若一致性在99%以上，则判定该物种为西藏鱼类寄生的异肉吸虫。2.根据权利要求1所述西藏鱼类寄生异肉吸虫的检测鉴定方法，其特征在于，所述虫体样本的采集方法，刮取鱼类消化道的内容物和粘液，置于玻璃板中，并用同样大小的玻璃板挤压，使内容物和粘液分散展开，采用便携式解剖镜观察虫体形态并采集样本。3.根据权利要求2所述西藏鱼类寄生异肉吸虫的检测鉴定方法，其特征在于，所述玻璃板的大小为10*10cm。4.根据权利要求1所述西藏鱼类寄生异肉吸虫的检测鉴定方法，其特征在于，所述异肉吸虫的形态特征为：虫体较肥厚，向头尾两端延长，...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘瑛子，
申请(专利权)人：西藏自治区农牧科学院水产科学研究所，
类型：发明
国别省市：