一种血管内皮生长因子抑制蛋白及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种血管内皮生长因子抑制蛋白及其制备方法与应用，属于基因工程技术领域。解决了现有技术中内皮生长因子单克隆抗体药物工艺复杂，成本高等技术问题。本发明专利技术的血管内皮生长因子抑制蛋白，包括以下氨基酸序列：SEQ ID NO：1。该血管内皮生长因子抑制蛋白安全，稳定，药效明确直接，毒副作用小，不易于产生耐药性，存储和运输条件较为温和，且制备成本低，易于临床推广使用。易于临床推广使用。易于临床推广使用。

【技术实现步骤摘要】
一种血管内皮生长因子抑制蛋白及其制备方法与应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种血管内皮生长因子抑制蛋白及其制备方法与应用，尤其涉及该抑制蛋白在制备用于治疗由于大量新生血管生成所引发的视网膜新生血管性疾病的药物中的应用。

技术介绍

[0002]多种视网膜疾病与新生血管有关，该类疾病的共同病理改变是视网膜由于缺血、缺氧而产生新生血管，进而血管发生渗漏、增殖、牵拉，导致反复玻璃体积血、牵拉性视网膜脱离及新生血管性青光眼，病程进展迅速，如不及时治疗，最终会导致失明。
[0003]血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用。VEGFR主要包括VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3，其中VEGFR2是血管新生和有丝分裂过程主要的VEGF信号转导受体。VEGF/VEGFR2所介导的信号级联通路可以调控血管内皮细胞的增殖、迁移、存活，引起血管通透性的改变，控制血管的新生。
[0004]现有技术中，治疗与新生血管有关的视网膜疾病，主要采用内皮生长因子单克隆抗体药物。其治疗原理为：由于VEGF和VEGF抗体能够特异的结合，因此能够与细胞表面VEGF受体竞争性结合VEGF。当VEGF与抗体形成复合物后就不会再激活细胞表面的VEGFR。这样VEGF介导的新血管生成的细胞信号通路就会被阻断，从而达到治疗的目的。但由于VEGF单克隆抗体整个制备工艺复杂，导致这类药物成本很高，最终导致药品价格昂贵，会极大的增加患者的负担。
[0005]有鉴于此，有必要研究一种基于降低VEGF的促进血管生成的活性的药物，解决现有技术中内皮生长因子单克隆抗体药物存在的技术问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术为解决现有技术中内皮生长因子单克隆抗体药物工艺复杂，成本高等技术问题，提供一种血管内皮生长因子抑制蛋白及其制备方法与应用。
[0007]本专利技术解决上述技术问题采取的技术方案如下。
[0008]本专利技术的血管内皮生长因子抑制蛋白，包括以下氨基酸序列：SEQ ID NO：1。
[0009]本专利技术还提供上述血管内皮生长因子抑制蛋白的制备方法为：
[0010]将氨基酸序列SEQ ID NO：1克隆入质粒中，得到的重组质粒转化入大肠杆菌中进行诱导表达，诱导表达结束后，离心收集菌体，并将菌体破碎，再离心获得上清蛋白，上清蛋白经过亲和层析进行纯化，脱盐层析，分子筛柱纯化，获得血管内皮生长因子抑制蛋白。
[0011]优选的是，使用NED1和XhoII将氨基酸序列SEQ ID NO：1克隆入PET21b质粒中。
[0012]优选的是，所述诱导表达的温度为37℃。
[0013]优选的是，所述诱导表达采用的诱导剂为IPTG，更优选的是，诱导剂的浓度为0.2mM。
[0014]优选的是，所述离心收集菌体的离心转速为4000rpm。
[0015]优选的是，所述菌体破碎采用的设备为超声波破碎仪。
[0016]优选的是，所述离心获得上清蛋白的离心转速为13000rpm。
[0017]优选的是，亲和层析采用Ni
‑
NTA亲和层析柱，使用Wash Buffer洗涤杂蛋白，然后使用Elution Buffer洗脱蛋白。
[0018]优选的是，过G25脱盐柱进行脱盐层析。
[0019]优选的是，分子筛柱纯化使用Superdex75分子筛柱子对蛋白进行纯化，流速为0.5ml/min。
[0020]本专利技术还提供上述血管内皮生长因子抑制蛋白在制备用于治疗视网膜新生血管性疾病的药物中的应用。
[0021]优选的是，所述血管内皮生长因子抑制蛋白的浓度为＞100pM。
[0022]本专利技术还提供含有上述血管内皮生长因子抑制蛋白的治疗视网膜新生血管性疾病的药物。
[0023]优选的是，所述血管内皮生长因子抑制蛋白的浓度为＞100pM。
[0024]本专利技术的原理为：本专利技术的血管内皮生长因子抑制蛋白包括VEGFR1和VE GFR2的部分细胞外序列，因此根据受体和配体能够特异结合的原理，本专利技术的血管内皮生长因子抑制蛋白能够和VEGF特异性的结合从而降低VEGF与细胞表面VEGFR1和VEGFR2结合的几率，从而降低VEGF所介导的眼底心血管生成。
[0025]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
[0026]本专利技术的血管内皮生长因子抑制蛋白安全，稳定，药效明确直接，毒副作用小，不易于产生耐药性，存储和运输条件较为温和。
[0027]本专利技术的血管内皮生长因子抑制蛋白的制备方法，使用原核表达系统制备，方法更简单，成本与VEGF单克隆抗体相比大大的降低，因此价格便宜，易于临床推广使用，具有重大的社会效益。
附图说明
[0028]为了更清楚地说明本专利技术实施例中的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
[0029]图1为本专利技术的血管内皮生长因子抑制蛋白的氨基酸序列来源示意图。
[0030]图2为本专利技术实施例1中在不同诱导温度(16
‑
37℃)和不同IPTG浓度(0.1
‑
0.3mM)下，在大肠杆菌中进行诱导表达制备血管内皮生长因子抑制蛋白的结果，图中，M表示蛋白质Marker。
[0031]图3为本专利技术实施例1中Ni
‑
NTA亲和层析纯化血管内皮生长因子抑制蛋白电泳图，图中，M代表蛋白Marker，前代表诱导前，8h代表诱导后8h的全菌，上代表上清蛋白，沉代表沉淀蛋白，FL代表过Ni柱的流穿液，W1代表洗涤液，E1代表VEGFR洗脱液。
[0032]图4为本专利技术实施例1中使用Superdex75分子筛柱对蛋白进行精细纯化后的电泳图。
[0033]图5为本专利技术实施例1中的血管内皮生长因子抑制蛋白的抑制VEGF介导的HUVEC增殖效果图。
具体实施方式
[0034]为了进一步理解本专利技术，下面对本专利技术优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本专利技术的特征和优点，而不是对本专利技术权利要求的限制。
[0035]如图1所示，本专利技术的血管内皮生长因子抑制蛋白，包括三个VEGFR的细胞外功能结构域，即D1、D2和D3。其中，1个结构域(D1)来自于VEGFR1蛋白，2个(D2和D3)来自于VEGFR2蛋白。具体的，本专利技术的血管内皮生长因子抑制蛋白包括以下氨基酸序列：PEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIP DGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRGGGGSHGIEL本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.血管内皮生长因子抑制蛋白，其特征在于，包括以下氨基酸序列：SEQ I D NO：1。2.权利要求1所述的血管内皮生长因子抑制蛋白的制备方法，其特征在于：将氨基酸序列SEQ ID NO：1克隆入质粒中，得到的重组质粒转化入大肠杆菌中进行诱导表达，诱导表达结束后，离心收集菌体，并将菌体破碎，再离心获得上清蛋白，上清蛋白经过亲和层析进行纯化，脱盐层析，分子筛柱纯化，获得血管内皮生长因子抑制蛋白。3.根据权利要求2所述的血管内皮生长因子抑制蛋白的制备方法，其特征在于：使用NED1和XhoII将氨基酸序列SEQ ID NO：1克隆入PET21b质粒中。4.根据权利要求2所述的血管内皮生长因子抑制蛋白的制备方法，其特征在于：所述诱导表达的温度为25℃；所述诱导表达采用的诱导剂为IPTG，浓度为0.2mM。5.根据权利要求2所述的血管内皮生长因子抑制蛋白的制备方法，其特征在于：所述离心收集菌体的离心转速为4000rpm；所述菌体破碎采用的设备为超声波破碎仪；所述离心获得上清蛋白的离心转速为13000rpm。6.根据权利要求2所述的血管内皮生长因子抑制蛋白的制备方法，其特征在于：亲和层析采用Ni
‑
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【专利技术属性】
技术研发人员：左玲，燕洪涛，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：