一种肿瘤双靶向的三特异性T细胞衔接器及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种肿瘤双靶向的三特异性T细胞衔接器的制备及其应用，涉及生物制药技术领域。本发明专利技术肿瘤双靶向的三特异性T细胞衔接器在细胞水平上具有更好的特异性T细胞激活、增殖活性及T细胞抗肿瘤活性，而且能够更有效地聚集于实体瘤内部，有利于实体瘤的治疗，因此，本发明专利技术的三特异性T细胞衔接器或其编码的基因可用于制成抗肿瘤药物。该肿瘤双靶向的三特异性T细胞衔接器的制备方法有着制备简便且表达水平较高的优点。表达水平较高的优点。表达水平较高的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种肿瘤双靶向的三特异性T细胞衔接器及其应用


[0001]本专利技术涉及生物制药
，特别是涉及一种肿瘤双靶向的三特异性T细胞衔接器的制备及其应用。

技术介绍

[0002]癌症已经成为危害人类健康的重要疾病。近年来，T细胞衔接器成为了热门的抗体类抗肿瘤药物之一，展示了良好的抗肿瘤效果。其作用机理主要是通过靶向肿瘤抗原与T细胞CD3结构域，形成“肿瘤细胞
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T细胞衔接器
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T细胞”免疫突触，介导T细胞参与诱导下游信号传导事件，激活T细胞的细胞毒性机制(包括细胞因子释放等)，导致肿瘤细胞死亡。
[0003]靶点选择是T细胞衔接器治疗肿瘤成功与否的关键因素之一，目前T细胞衔接器的靶点主要局限于膜蛋白胞外区域，不但选择范围十分有限(膜蛋白占细胞总蛋白～8％)，而且特异性不强。因此，新靶点探寻成为T细胞衔接器研发的重要任务之一。胞内蛋白(包括肿瘤突变蛋白)可在蛋白酶体中降解成抗原肽，再由HLAI类分子递呈到细胞表面形成多肽
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HLA复合物(peptide
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HLA complex，pHLA)，被T细胞受体(T
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cell receptor，TCR)识别。
[0004]目前，TCR疗法可靶向细胞内外抗原，但此抗原肽片段(antigen peptide)必须在肿瘤细胞上通过与特定pHLA复合体结合而呈现，因此，将鉴定出在肿瘤中高度表达但在健康组织内罕见、具高度TCR亲和力的pHLA复合体作为研究的首要目标。
[0005]由于pHLA的靶点选择范围广、特异性强，且TCR因胸腺选择而与pHLA识别具有高度特异性，基于TCR的T细胞衔接器是极具潜力的肿瘤免疫治疗药物。但pHLA的表达量极低，单个细胞递呈特定的pHLA在几个至几千个，远低于传统肿瘤表面高表达抗原(几万
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几十万)，极大地影响了基于TCR的T细胞衔接器的体内靶向性以及抗肿瘤活性。而以pHLA和传统肿瘤表面高表达抗原为靶点的三特异性T细胞衔接器兼具了pHLA与传统肿瘤表面高表达抗原的特点，是一个解决pHLA表达量低的良好策略之一。但该方法目前还未见报道，其中涉及很多问题亟需解决，所以一种特异性良好的基于TCR的肿瘤双靶向T细胞衔接器有待开发。

技术实现思路

[0006]本专利技术提供了一种以TCR和EGFR为靶抗原的基于TCR的三特异性T细胞衔接器的制备方法和应用。
[0007]本专利技术的具体的技术方案如下：
[0008]本专利技术提供了一种肿瘤双靶向的三特异性T细胞衔接器，包括一个包含IgG抗体恒定区的骨架，所述骨架包括两条重链和两条轻链，重链包括重链恒定区CH1、CH2、CH3，轻链包括CL，所述肿瘤双靶向的三特异性T细胞衔接器为异源四聚体，为以下任意一种形式：
[0009](1)第一亚基包括T细胞受体α链的可变区、恒定区及所述骨架中的一条轻链，第二亚基包括T细胞受体β链的可变区、恒定区及所述骨架中的一条重链，第三亚基包括抗EGFR抗体的重链可变区及所述骨架中的另一条重链，第四亚基包括抗EGFR抗体的轻链可变区及所述骨架中的另一条轻链；其中，第三亚基中的抗EGFR抗体的重链可变区和第四亚基中的
No.4所示。
[0018]本专利技术还提供了所述三特异性T细胞衔接器的制备方法，包括以下步骤：(1)构建表达第一亚基的编码基因、第二亚基的编码基因、第三亚基的编码基因和第四亚基的编码基因载体；(2)将步骤(1)表达第一亚基的编码基因、第二亚基的编码基因、第三亚基的编码基因和第四亚基的编码基因载体转染到哺乳动物细胞中，培养后进行蛋白纯化，得到所述三特异性T细胞衔接器。优选的，步骤(1)所述载体为pLVX
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Puro；步骤(2)所述哺乳动物细胞为293F细胞。本专利技术还提供了所述三特异性T细胞衔接器在制备抗肿瘤药物中的应用。本专利技术还提供了所述的基因在制备抗肿瘤药物中的应用。本专利技术还提供了一种抗肿瘤药物，活性成分为所述三特异性T细胞衔接器或所述的基因。
[0019]本专利技术的有益效果：本专利技术肿瘤双靶向的三特异性T细胞衔接器在细胞水平上具有更好的特异性T细胞激活、增殖活性及T细胞抗肿瘤活性，而且能够更有效地聚集于实体瘤内部，有利于实体瘤的治疗，因此，本专利技术的三特异性T细胞衔接器或其编码的基因可用于制成抗肿瘤药物。该肿瘤双靶向的三特异性T细胞衔接器的制备方法有着制备简便且表达水平较高的优点。
附图说明
[0020]图1为肿瘤双靶向的三特异性T细胞衔接器及其对照分子的分子形式图。
[0021]图2为肿瘤双靶向的三特异性T细胞衔接器及其对照分子的去糖基化分析图。其中，(a)tNY
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aEGFR/aCD3和tNY/aCD3的去糖基化分析图，Lane 1：tNY/aCD3；Lane2：PNGase处理的tNY/aCD3；Lane 3：tNY
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aEGFR/aCD3；Lane 4：PNGase处理的tNY
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aEGFR/aCD3；(b)tNY
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aCD3/aEGFR和对照分子的去糖基化分析图；Lane 1：PNGase处理的tNY
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aCD3/aEGFR；Lane 2：tNY
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aCD3/aEGFR；Lane 3：PNGase处理的tCrtl
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aCD3/aEGFR；Lane 4：tCrtl
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aCD3/aEGFR；Lane 5：PNGase处理的tNY
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aCD3/aCtrl；Lane 6：tNY
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aCD3/aCtrl；Lane 7：PNGase；Lane 8：tNY/aEGFR；Lane 9：PNGase处理的tNY/aEGFR。
[0022]图3为肿瘤双靶向的三特异性T细胞衔接器及其对照分子对NY
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ESO
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1SLL/HLA
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A*02：01的特异性亲和力分析图。(a)tNY
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aEGFR/aCD3和tNY/aCD3对NY
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ESO
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1 SLL/HLA
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A*02：01的亲和力分析；(b)tNY
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aEGFR/aCD3和tNY/aCD3对NY
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ESO
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1 SLL/HLA
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A*02：01的特异性亲和力分析；(c)tNY
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aCD3/aEGFR及其对照分子对NY
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ESO
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1 SLL/HLA
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A*02：01的亲和力分析；(d)tNY
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aCD3/aEGFR及其对照分子对NY
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ESO
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1 SLL/HLA
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A*02：01的特异性亲和力分析。
[0023]图4为肿瘤双靶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤双靶向的三特异性T细胞衔接器，包括一个包含IgG抗体恒定区的骨架，所述骨架包括两条重链和两条轻链，重链包括重链恒定区CH1、CH2、CH3，轻链包括CL，其特征在于，所述肿瘤双靶向的三特异性T细胞衔接器为异源四聚体，为以下任意一种形式：(1)第一亚基包括T细胞受体α链的可变区、恒定区及所述骨架中的一条轻链，第二亚基包括T细胞受体β链的可变区、恒定区及所述骨架中的一条重链，第三亚基包括抗EGFR抗体的重链可变区及所述骨架中的另一条重链，第四亚基包括抗EGFR抗体的轻链可变区及所述骨架中的另一条轻链；其中，第三亚基中的抗EGFR抗体的重链可变区和第四亚基中的抗EGFR抗体的轻链可变区构成抗EGFR抗体结构域；所述第一亚基或第四亚基上还连接有抗CD3抗体的重链可变区和轻链可变区；(2)第一亚基包括T细胞受体α链的可变区、恒定区及所述骨架中的一条轻链，第二亚基包括T细胞受体β链的可变区、恒定区及所述骨架中的一条重链，第三亚基包括抗CD3抗体的重链可变区及所述骨架中的另一条重链，第四亚基包括抗CD3抗体的轻链可变区及所述骨架中的另一条轻链；其中，第三亚基中的抗CD3抗体的重链可变区和第四亚基中的抗CD3抗体的轻链可变区构成抗CD3抗体结构域；所述骨架中的两条重链上还连接有抗EGFR抗体的重链可变区和轻链可变区；上述(1)和(2)中，第一亚基中的T细胞受体α链的可变区和恒定区与第二亚基中的T细胞受体β链的可变区和恒定区构成用于识别抗原肽
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HLA复合物的T细胞受体结构域。2.如权利要求1所述的三特异性T细胞衔接器，其特征在于，所述IgG抗体为人源IgG抗体。3.如权利要求l所述的三特异性T细胞衔接器，其特征在于，所述抗CD3抗体为抗CD3ε抗体。4.如权利要求l所述的三特异性T细胞衔接器，其特征在于，第二亚基和第三亚基中的两个CH3之间分别使用knob
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into
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hole技术设计成knob结构和hole结构。5.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈莹，赵文彬，金世洁，刘文慧，陈枢青，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：