同时靶向人CD73及人TGFβ的双功能融合蛋白、其制备方法和用途技术

本发明专利技术提供了一种同时靶向人CD73及人TGFβ的双功能融合蛋白、其制备方法和用途。具体地，提供了一种双功能融合蛋白，其包含特异性结合靶分子CD73蛋白的第一结合结构域；和特异性结合靶分子TGFβ蛋白的第二结合结构域。本发明专利技术的抗CD73和TGFβ的双功能融合蛋白具有与双靶标结合亲和力高、特异性强等优势，能显著的改善肿瘤微环境免疫，增强抗肿瘤效应，具有重要的临床应用前景。重要的临床应用前景。

【技术实现步骤摘要】
同时靶向人CD73及人TGF
β
的双功能融合蛋白、其制备方法和用途


[0001]本专利技术涉及抗体领域。具体地，涉及同时靶向人CD73及人TGFβ的双功能融合蛋白、其制备方法和用途。

技术介绍

[0002]研究发现，肿瘤免疫疗法响应不佳的主要原因之一是在肿瘤微环境中存在抑制免疫细胞的物质，其会导致肿瘤细胞逃脱免疫细胞的杀伤。而腺苷就是肿瘤微环境中产生肿瘤免疫抑制的重要物质之一，其通过与腺苷受体(A2AR)的结合，激活蛋白激酶A(PKA)和Csk激酶，抑制LCK、MAPK、PKC等一系列与免疫激活相关的信号通路，发挥免疫抑制作用。CD73是由NT5E基因编码的胞外
‑
5'
‑
核苷酸酶，分子量为70kD，是催化AMP脱磷酸生成腺苷的主要限速酶。CD73的表达受到低氧诱导因子
‑
1(HIF
‑
1)、TGFβ、EGFR、AKT、β
‑
catenin等分子的调控，尤以行使转录因子功能的HIF
‑
1最为关键。低氧(Hypoxia)是肿瘤微环境的一个重要特征，低氧诱导HIF
‑
1上调，进而导致CD73在肿瘤微环境广泛表达。因此，研究发现CD73在多种肿瘤细胞表面存在过表达，并与肿瘤的侵袭迁移和不良预后密切相关，包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌、结直肠癌、肾癌、胃癌、头颈癌等。
[0003]临床前研究显示，抑制CD73可能刺激T细胞的活性，并增强腺苷调控的T细胞和其它免疫细胞水平的抗肿瘤免疫监测。解除肿瘤微环境(TME)对免疫效应细胞的抑制作用是克服免疫疗法耐药、提高疗效一个很重要的方面。因此，通过抑制CD73的酶活性来阻断腺苷的产生直接破坏腺苷介导的免疫抑制将会是一种极具前途的治疗策略。
[0004]转化生长因子
‑
β(TGFβ)是多效性细胞因子，既能抑制癌前细胞导致的肿瘤进展，也可促使晚期肿瘤的扩散。在晚期原发性和转移性肿瘤中，TGFβ的高表达与临床预后差、肿瘤治疗耐药有关，其中原因包括如下几点：1)TGFβ可以显著抑制树突状细胞的功能和CD4
+
或CD8
+
T细胞的增殖，同时TGFβ会促进调节性T细胞(Treg)和髓样衍生的抑制细胞(MDSC)的分化，形成免疫抑制的微环境；2)TGFβ会通过激活ALK1等，显著提高VEGF/VEGF
‑
R的表达促进肿瘤血管生成；3)TGFβ通过激活经典的smad通路或非smad通路，诱导snail1/2，ZEB1/2和HMGA2等转录因子的表达，从而促进上皮间充质转化(EMT)，使得细胞获得迁移、浸润，实现癌细胞向其他组织的扩散。
[0005]在抗肿瘤研究中发现，TGFβ1与CD73在肿瘤发展进程中有密切关系。从肿瘤细胞自身层面来说，在宫颈癌中发现，宫颈癌细胞分泌TGFβ1依赖于CD73
‑
腺苷通路，而TGFβ1又会反过来维持细胞表面的CD73表达。从肿瘤微环境层面来说，临床研究发现乳腺癌细胞可以诱导γδT细胞(γδT细胞被认为是乳腺癌肿瘤浸润淋巴细胞的重要组成部分)表达CD73，而其诱导过程依赖于TGFβ1。
[0006]因此，鉴于人CD73和TGFβ在调节肿瘤免疫应答中的明显作用，设计同时拮抗CD73及TGFβ药物在癌症治疗方面应具有广阔的应用前景。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种同时靶向人CD73及人TGFβ的双功能融合蛋白、其制备方法和用途。
[0008]在本专利技术的第一方面，提供了一种双功能融合蛋白，所述双功能融合蛋白包含：
[0009]第一结合结构域D1；和
[0010]第二结合结构域D2；
[0011]其中，D1特异性结合靶分子CD73蛋白；
[0012]D2特异性结合靶分子TGFβ蛋白；其中，所述D1为抗CD73抗体或其抗原结合片段；所述抗CD73抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含以下的互补决定区CDR：
[0013]SEQ ID NO.1所示的HCDR1，
[0014]SEQ ID NO.2所示的HCDR2，和
[0015]SEQ ID NO.3所示的HCDR3；和
[0016]所述的轻链可变区具有选自下组的互补决定区CDR：
[0017]SEQ ID NO.4所示的LCDR1，
[0018]SEQ ID NO.5所示的LCDR2，和
[0019]SEQ ID NO.6所示的LCDR3。
[0020]在另一优选例中，所述的靶分子TGFβ蛋白选自下组：TGFβ1蛋白、TGFβ2蛋白、TGFβ3蛋白、或其组合。
[0021]在另一优选例中，所述的抗体包括：动物源抗体(如鼠源抗体)、嵌合抗体、人源化抗体。
[0022]在另一优选例中，所述的抗体为IgG类抗体。
[0023]在另一优选例中，所述的抗原结合片段包含单链可变区片段(scFv)、双链可变区片段(dcFv)。
[0024]在另一优选例中，所述的抗CD73抗体的重链可变区含有SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列。
[0025]在另一优选例中，所述的抗CD73抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.17所示的氨基酸序列。
[0026]在另一优选例中，所述D2为特异性结合TGFβ1蛋白、TGFβ2蛋白或TGFβ3蛋白的多肽片段。
[0027]在另一优选例中，所述D2为特异性结合TGFβ1蛋白的多肽片段，并且所述多肽片段衍生自TGFβ受体。
[0028]在另一优选例中，所述D2为TGFβRⅡ胞外结构域元件。
[0029]在另一优选例中，所述TGFβRⅡ胞外结构域元件包含TGFβRII胞外区部分片段及其突变体。
[0030]在另一优选例中，所述TGFβRⅡ胞外结构域元件选自下组中的一种或多种：
[0031](1)SEQ ID NO.7的460位
‑
588位；
[0032](2)SEQ ID NO.8的460位
‑
588位；
[0033](3)SEQ ID NO.9的460位
‑
588位；
[0034](4)SEQ ID NO.10的460位
‑
596位；
[0035](5)SEQ ID NO.11的460位
‑
587位。
[0036]在另一优选例中，所述D1和所述D2通过接头相连。
[0037]在另一优选例中，所述接头为柔性接头。
[0038]在另一优选例中，所述的柔性接头包括5
‑
30个氨基酸，较佳地10
‑
25个氨基酸。
[0039]在另一优选例中，所述接头为(G4S)
n
，或(G4S)
n
G，其中n为1、2、3或4，较佳地n为3。
[004本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种双功能融合蛋白，其特征在于，所述双功能融合蛋白包含：第一结合结构域D1；和第二结合结构域D2；其中，D1为抗CD73抗体或其抗原结合片段；D2特异性结合靶分子TGFβ的蛋白；所述抗CD73抗体包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含以下的互补决定区CDR：SEQ ID NO.1所示的HCDR1，SEQ ID NO.2所示的HCDR2，和SEQ ID NO.3所示的HCDR3；和所述轻链可变区包含以下的互补决定区CDR：SEQ ID NO.4所示的LCDR1，SEQ ID NO.5所示的LCDR2，和SEQ ID NO.6所示的LCDR3。2.如权利要求1所述的双功能融合蛋白，其特征在于，所述抗CD73抗体的重链可变区含有SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列。3.如权利要求1所述的双功能融合蛋白，其特征在于，所述抗CD73抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO.17所示的氨基酸序列。4.如权利要求1所述的双功能融合蛋白，其特征在于，所述D2为TGFβRⅡ胞外结构域元件。5.如权利要求4所述的双功能融合蛋白，其特征在于，所述TGFβRⅡ胞外结构域元件选自下组中的一种或多种：(1)SEQ ID NO.7的460位
‑
588位；(2)SEQ ID NO.8的460位
‑
588位；(3)SEQ ID NO.9的460位
‑
588位；(4)SEQ ID NO.10的460位
‑
596位；(5)SEQ ID NO.11的460位
‑
587位。6.如权利要求1所述的双功能融合蛋白，其特征在于，所述的双功能融合蛋白中的每个单体从N端到C端具有如式I所示的结构：其中，T1、T2、T3、T4各自独立地为无或TGFβRⅡ胞外结构域元件，且至少一个不为无；L1、L2、L3、L4各自独立地为无或键或接头；VL代表抗CD73抗体的轻链可变区；CL代表抗CD73抗体的轻链恒定区；VH代表抗CD73抗体的重链可变区；
CH代表抗CD73抗体的重链恒定区；“～”代表二硫键或共价键；
“‑”
代表肽键；其中，所述双功能融合蛋白具有同时结合TGFβ以及结合CD73的活性。7.如权利要求1所述的双功能融合蛋白，其特征在于，所述的双功能融合蛋白选自下组：(1)所述融合蛋白的重链氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，所述融合蛋白的轻链氨基酸序列如SEQ ID...

【专利技术属性】
技术研发人员：张学赛，李晴柔，黄浩旻，朱祯平，
申请(专利权)人：三生国健药业上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：