本发明专利技术属于生物工程技术领域，特别涉及到一种苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的自组装方法和应用。本发明专利技术将拉链蛋白通过刚性连接子连接到PDH和FDH的N端或C端，分别得到带拉链的PDH和FDH，将带拉链的PDH和FDH进行混合制备PDH和FDH自组装蛋白。所得自组装蛋白具有成本低、易于操作的优点，并且提高了NADH的循环速度，自组装酶的温度稳定性和和底物转化速度相对游离酶均有显著提高，在催化酮基胺化反应中，特别是沙格列汀手性药物中间体的工业化生产中具有极高的应用价值。产中具有极高的应用价值。产中具有极高的应用价值。
【技术实现步骤摘要】
苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的自组装蛋白及其应用
：
[0001]本专利技术属于生物工程
，特别涉及到一种苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的自组装方法和应用。
技术介绍
：
[0002]苯丙氨酸脱氢酶(PDH)是一种氧化还原酶，其正反应可在NAD
+
存在的情况下催化L
‑
苯丙氨酸氧化脱氨基生产苯丙酮酸、NADH和NH
4+
；逆反应可在NADH和NH
4+
存在的情况下催化含有酮基的化合物胺化。PDH这一催化特性使其已成为临床检测苯丙酮尿症血液中苯丙氨酸含量的试剂用酶。此外，在合成手性化合物方面，PDH可以催化酮酸与氨生成具有手性的芳香族氨基酸；还可用于合成手性醛基赖氨酸乙缩醛；以及催化合成(S)
‑3‑
羟基金刚烷基甘氨酸的还原胺化反应。这些过程常常需要消耗大量昂贵的辅因子NADH，通过使用甲酸脱氢酶(FDH)对PDH反应消耗的NAD
+
进行循环利用，使反应持续进行。
[0003]然而，这个反应涉及辅因子(NADH/NAD/ATP)循环利用，苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的距离难以控制，甲酸脱氢酶再生的NADH需要扩散到苯丙氨酸脱氢酶活性中心才能起作用，在工业应用中效率低下。为了解决这些缺点，需要开发一种组装酶策略，以提高工业中的辅因子循环效率。
[0004]自组装蛋白(Self
‑
assembledprotein)是一种缩短多种酶之间距离的技术，具有菌种构建完成后只需更换菌种，其他操作不变的优点，适用于需要辅因子的工业生产。然而目前尚未有利用自组装蛋白技术应用于苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的研究，与两种游离酶简单的混合在一起进行催化相比，自组装酶缩短了主酶和辅酶的距离，提高了辅因子NADH的利用效率，从而提高了催化效率。
[0005]因此，本专利技术中，将利用自组装技术获得一种苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶自组装蛋白，进一步提高苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的催化效率。
技术实现思路
：
[0006]本专利技术提供的技术方案之一，是一种苯丙氨酸脱氢酶(PDH)和甲酸脱氢酶(FDH)自组装蛋白的制备方法，将拉链蛋白通过刚性连接子连接到PDH和FDH的N端或C端，分别得到带拉链的PDH和FDH，将带拉链的PDH和FDH进行混合制备PDH和FDH自组装蛋白，制备方法包括以下步骤：
[0007](1)将拉链蛋白(ZE或ZR)编码基因、刚性连接子编码基因与苯丙氨酸脱氢酶编码基因连接起来，通过同源重组的方式与表达质粒连接后，化转入大肠杆菌，获得可以表达带拉链的苯丙氨酸脱氢酶的重组菌株；
[0008](2)将拉链蛋白(ZE或ZR)编码基因、刚性连接子编码基因与甲酸脱氢酶编码基因连接起来，通过同源重组的方式与表达质粒连接后，化转入大肠杆菌，获得可以表达带拉链的甲酸脱氢酶的重组菌株；
[0009]进一步地，所述苯丙氨酸脱氢酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
[0010]进一步地，所述甲酸脱氢酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
[0011]进一步地，所述拉链蛋白包括但不限于富含精氨酸的拉链蛋白ZR，富含谷氨酸的拉链蛋白ZE，PDZ结构域和PDZ配体，SpyTag/SpyCatcher，以及Snooptag/SnoopCatcher；
[0012]更近一步地，所述富含精氨酸的拉链蛋白ZR，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
[0013]更近一步地，所述富含谷氨酸的拉链蛋白ZE，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；
[0014]进一步地，所述刚性连接子包括但不限于富含脯氨酸的刚性连接子EPPPPLPPLPPPPPP，脯氨酸刚性连接子PLP15，刚性连接子PLright等；
[0015]优选地，所述刚性连接子为富含脯氨酸的刚性连接子EPPPPLPPLPPPPPP，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
[0016]进一步地，所述表达质粒包括但不限于pET质粒，pEGX质粒，pPICZ质粒或pET
‑
28a质粒等；
[0017]优选地，所述表达质粒为pET
‑
28a质粒；
[0018]进一步地，所述大肠杆菌包括但不限于大肠杆菌BL21(DE3)、大肠杆菌JM109等；
[0019]优选地，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21(DE3)；
[0020](3)表达所述的重组菌株，破碎后离心去除细胞碎片分别得到带拉链的苯丙氨酸脱氢酶酶液和带拉链的甲酸脱氢酶粗酶液；
[0021]优选地，将拉链蛋白ZR编码基因和富含脯氨酸的刚性连接子编码基因融合到苯丙氨酸脱氢酶编码基因的N端(ZR
‑
PDH)并连接到质粒pET
‑
28a的多克隆位点MCS；将拉链蛋白ZE编码基因和含脯氨酸的刚性连接子基因融合到甲酸脱氢酶编码基因的N端(ZE
‑
FDH)并连接到质粒pET
‑
28a的多克隆位点MCS；将构建好的质粒通过化转的方法分别导入大肠杆菌BL21(DE3)获得重组菌株；表达所述的重组菌株，破碎后离心去除细胞碎片分别得到带拉链的苯丙氨酸脱氢酶粗酶液和带拉链的甲酸脱氢酶粗酶液。
[0022](4)将得到的粗酶液纯化后分别得到带拉链的苯丙氨酸脱氢酶纯酶液和带拉链的甲酸脱氢酶纯酶液，将纯酶溶液按照不同比例混合，获得苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的自组装酶液；
[0023]进一步地，对粗酶液采用镍柱纯化并除盐；
[0024]进一步地，将相同浓度带拉链的苯丙氨酸脱氢酶纯酶液和带拉链的甲酸脱氢酶纯酶液按照体积比1:1
‑
5的比例混合，获得苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的自组装酶液；
[0025]优选地，将相同浓度带拉链的苯丙氨酸脱氢酶纯酶液和带拉链的甲酸脱氢酶纯酶液按照体积比1:1的比例混合，获得苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的自组装酶液。
[0026]本专利技术提供的技术方案之二，是由上述方法制备的苯丙氨酸脱氢酶与甲酸脱氢酶自组装蛋白酶。
[0027]本专利技术提供的技术方案之三，是上述自组装蛋白酶的应用，特别是在催化酮基胺化反应中的应用，更特别是在催化生产沙格列汀中间体的应用。
[0028]进一步地，在制备催化沙格列汀中间体2
‑
(3
‑
羟基
‑1‑
金刚烷)
‑2‑
氧代乙酸时，底物为2
‑
(3
‑
羟基
‑1‑
金刚烷)
‑2‑
氧代乙酸，底物浓度为20g/L
‑
100g/L，酶浓度为0.1mg/mL
‑
30mg/mL，反应时间为5
‑
80h，反应温度为25
‑
75℃，反应为PH 5
‑
10。
[0029]本专利技术的有益效果：
[0030]本本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶自组装蛋白的制备方法，其特征在于，将拉链蛋白通过刚性连接子连接到PDH和FDH的N端或C端，分别得到带拉链的PDH和FDH，将带拉链的PDH和FDH进行混合制备PDH和FDH自组装蛋白。2.如权利要求1所述的一种苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶自组装蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将拉链蛋白编码基因、刚性连接子编码基因与苯丙氨酸脱氢酶编码基因连接起来，通过同源重组的方式与表达质粒连接后，化转入大肠杆菌，获得可以表达带拉链的苯丙氨酸脱氢酶的重组菌株；(2)将拉链蛋白编码基因、刚性连接子编码基因与甲酸脱氢酶编码基因连接起来，通过同源重组的方式与表达质粒连接后，化转入大肠杆菌，获得可以表达带拉链的甲酸脱氢酶的重组菌株；(3)表达所述的重组菌株，破碎后离心去除细胞碎片分别得到带拉链的苯丙氨酸脱氢酶酶液和带拉链的甲酸脱氢酶粗酶液；(4)将得到的粗酶液纯化后分别得到带拉链的苯丙氨酸脱氢酶纯酶液和带拉链的甲酸脱氢酶纯酶液，将纯酶溶液按照不同比例混合，获得苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶的自组装酶液。3.如权利要求2所述的一种苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶自组装蛋白的制备方法，其特征在于，所述苯丙氨酸脱氢酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述甲酸脱氢酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。4.如权利要求2所述的一种苯丙氨酸脱氢酶和甲酸脱氢酶自组装蛋白的制备方法，其特征在于，所述拉链蛋白包括但不限于富含精氨酸的拉链蛋白ZR，富含谷氨酸的拉链蛋白ZE，PDZ结构域和PDZ配体，SpyTag/SpyCatcher，以及Snooptag/SnoopCatcher；所述富含精氨酸的拉链蛋白ZR，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述富含谷氨酸的拉链蛋白ZE，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述刚性连接子包括但不限于富含脯氨酸的刚性连接子EPP...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘夫锋，陈锐派，延文星，路福平，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：
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