用于多重呼吸道病原体检测的引物探针组合物、试剂盒制造技术

本申请涉及一种用于多重呼吸道病原体检测的引物探针组合物、试剂盒。所述引物探针组合物中包括9组分别用于对待检测的9种呼吸道病原体进行检测的引物探针组；且所述9组分别用于对待检测的9种呼吸道病原体进行检测的引物探针组中的正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1~30所示。利用包括所述引物探针组合物的试剂盒，在一张微流控芯片中，一次注样，即可对9种常见的呼吸道病原体感染进行检测，实现对多种病原体同时平行检测，具有灵敏度高，特异性强，操作简便和快速的特点，可为疾病治疗、流行病学调查提供有力的支持。流行病学调查提供有力的支持。流行病学调查提供有力的支持。

【技术实现步骤摘要】
用于多重呼吸道病原体检测的引物探针组合物、试剂盒


[0001]本申请涉及分子诊断
，尤其是涉及一种用于多重呼吸道病原体检测的引物探针组合物、试剂盒。

技术介绍

[0002]呼吸道感染（Respiratory tract infection，RTI）是人类最常见的一类疾病，可以在任何性别、年龄和地域中发生。据统计，在急性呼吸道感染中90 %以上是由病毒引起的，大多数急性上呼吸道病毒感染具有感染力强、传播快、潜伏期短、发病急、以呼吸道局部免疫为主，感染后免疫力不持久等特点。
[0003]常见的呼吸道病毒有正粘病毒科的流感病毒、副粘病毒科的副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、冠状病毒、人偏肺病毒和多个亚型鼻病毒等。呼吸道病毒感染是以空气或飞沫形式传播的，传播速度快；病毒种类繁多，症状相似，临床上很难鉴别。因此，如何对常见呼吸道病毒感染进行快速准确的检测和监控一直是一项重要的研究热点。
[0004]目前对于呼吸道病毒感染的检测方法有病毒分离培养、免疫学检测、质谱检测，实时荧光PCR法等。病毒分离培养是呼吸道病毒感染诊断的金标准，但传统病毒培养存在周期长、运输和存贮过程中不易保持病毒感染性等问题，某些病毒如人偏肺病毒、鼻病毒、副流感病毒等进行细胞分离培养也较困难，病毒分离阳性率低，一般需１~２周才能观察到病变，不利于疾病早期诊断；同时病毒的分离培养对实验室环境的要求高，呼吸道病毒由于传染性强，分离培养要在BSL
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3实验室内进行，并遵循生物安全三级个人防护。免疫学检测操作快速简便，且不需要保持病毒的活性，但检测需要已知特异的抗原或抗体，且容易出现假阳性和假阴性，特异性和灵敏度不高。质谱检测是近些年发展起来的可用于病原体检测的技术平台，例如美国Abbott公司的Plex
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ID系统，将PCR扩增技术和电离质谱（ESI
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MS）技术整合，运用特定引物进行多重PCR扩增，之后对扩增产物进行全自动的ESI
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MS分析检测，质谱仪可对扩增产物进行准确至碱基构成方面的分析，试验数据与校准过的已知微生物标准数据库进行比对，便可确定所检测病原微生物的种类；Plex
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ID能够快速、精确测量选定基因区域的碱基构成，但仪器的成本过高和缺乏开放的基于碱基构成的数据库，限制了这一技术平台的广泛应用。实时荧光PCR是在常规PCR技术的基础上发展起来的核酸定量技术，通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累，对整个PCR 过程进行可视化的实时监测，使PCR反应与扩增产物的检测同时完成，与传统的检测方法相比，实时荧光PCR技术可进一步提高检测的灵敏度和准确性；而当下，多重荧光定量PCR已成为呼吸道病毒检测研究的热门，是在同一PCR反应体系内加入两对以上的引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，这种方法将实时定量PCR具有的快速准确定量、灵敏度高和特异性强的优势与多重PCR可同时检测多种病毒病原的特点结合在一起，更由于减少酶、荧光染料和探针的使用量，而大大降低了检测的成本；同时荧光定量PCR全程闭管检测，避免了普通PCR需要电泳等PCR产物开盖操作而造成的污染。但是多重定量PCR，由于仪器荧光通道的限制，其多重反应能力受到一定限制，每一PCR反应管只能检测3
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4个指标，对于多指标的检测，往往需要2管
甚至更多管，给检测带来很大的不便。

技术实现思路

[0005]为了解决现有技术的不足，本申请提供一种用于多重呼吸道病原体检测的引物探针组合物和包括所述引物探针组合物的基于微流控芯片结合荧光PCR探针的试剂盒，利用所述试剂盒在一张微流控芯片中，一次注样，即可对多种常见的呼吸道病原体感染进行检测，实现对多种病原体同时平行检测，具有灵敏度高，特异性强，操作简便和快速的特点，可为疾病治疗、流行病学调查提供有力的支持。
[0006]为此，本申请第一方面提供了一种用于多重呼吸道病原体检测的引物探针组合物，所述引物探针组合物中包括9组分别用于对待检测的9种呼吸道病原体进行检测的引物探针组；且所述9组分别用于对待检测的9种呼吸道病原体进行检测的引物探针组中的正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1~30所示。
[0007]本申请中，所述引物探针组合物中的正、反向引物和探针均针对各病原体的保守区域设计，保障检测结果的准确度，且通过比对分析和优化设计，确认了不同病原体间的特异性，且通过引物和探针的双重设计保障靶点识别的特异性。
[0008]本申请中，术语“引物”表示这样的寡核苷酸：其能够通过模板依赖性DNA聚合酶“引发”DNA合成，即例如寡核苷酸的3
’‑
末端提供游离3
’‑
OH基团，可以通过模板依赖性DNA聚合酶将更多的“核苷酸”连接至所述3
’‑
OH基团，建立3
’
至5
’
磷酸二酯键，由此使用脱氧核苷三磷酸，并且由此释放焦磷酸。
[0009]本申请中，术语“正向引物”，是沿着负链进行不间断延长的寡核苷酸；术语“反向引物”，是沿着正链进行不间断延长的寡核苷酸。应理解，当正链和反链的指定发生互换时，对应的正向引物和反向引物的命名也可随之互换。也即，本申请中的正向引物和反向引物是相对而言的。
[0010]本申请中，所述待检测的9种呼吸道病原体分别为：甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒1型、副流感病毒3型、呼吸道合胞病毒、腺病毒、肺炎支原体、人偏肺病毒和鼻病毒。
[0011]在一些具体实施方式中，用于检测甲型流感病毒的引物探针组中正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1~3所示；用于检测乙型流感病毒的引物探针组中正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:4~6所示；用于检测副流感病毒1型的引物探针组中正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7~9所示；用于检测副流感病毒3型的引物探针组中正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:10~12所示；用于检测呼吸道合胞病毒的引物探针组中正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:13~18所示；用于检测腺病毒的引物探针组中正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:19~21所示；用于检测肺炎支原体的引物探针组中正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如
SEQ ID NO:22~24所示；用于检测人偏肺病毒的引物探针组中正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:25~28所示；用于检测鼻病毒的引物探针组中正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:29~30所示。
[0012]本申请中，所检测的呼吸道合胞病毒包括两种型别，分别为A型和B型。具体地，用于检测呼吸道合胞病毒A型的正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:13~15所示；用于检测呼吸道合胞病毒B型的正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQID NO:1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于多重呼吸道病原体检测的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物中包括9组分别用于对待检测的9种呼吸道病原体进行检测的引物探针组；且所述9组分别用于对待检测的9种呼吸道病原体进行检测的引物探针组中的正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1~30所示。2.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述待检测的9种呼吸道病原体分别为：甲型流感病毒、乙型流感病毒、副流感病毒1型、副流感病毒3型、呼吸道合胞病毒、腺病毒、肺炎支原体、人偏肺病毒和鼻病毒。3.根据权利要求2所述的引物探针组合物，其特征在于，用于检测甲型流感病毒的引物探针组中正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:1~3所示；用于检测乙型流感病毒的引物探针组中正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:4~6所示；用于检测副流感病毒1型的引物探针组中正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:7~9所示；用于检测副流感病毒3型的引物探针组中正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:10~12所示；用于检测呼吸道合胞病毒的引物探针组中正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:13~18所示；用于检测腺病毒的引物探针组中正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:19~21所示；用于检测肺炎支原体的引物探针组中正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:22~24所示；用于检测人偏肺病毒的引物探针组中正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:25~28所示；用于检测鼻病毒的引物探针组中正、反向引物和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:29~30所示。4.根据权利要求1
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3中任意一项所述的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物中还包括3组分别针对3种质控的引物探针组，所述的3种质控...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐英春，朱华栋，王健伟，王瑶，史小伟，冯雯，庞彪，张国豪，
申请(专利权)人：北京百康芯生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：