L-苏氨酸3-脱氢酶和尿嘧啶透过酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术提供L

【技术实现步骤摘要】
L
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苏氨酸3
‑
脱氢酶和尿嘧啶透过酶突变体及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程和微生物发酵
，具体地说，涉及L
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苏氨酸3
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脱氢酶和尿嘧啶透过酶突变体及其应用。

技术介绍

[0002]核苷是一类糖苷的总称。核苷是核酸和核苷酸的组成成分。核苷是由D
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核糖或D
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Z
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脱氧核糖与嘧啶碱或嘌呤碱缩合而成。核苷一般为无色结晶，不溶于普通有机溶剂，易溶于热水，熔点为160～240℃。由D
‑
核糖生成的核苷称核糖核苷，参与RNA组成；由D
‑
α
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脱氧核糖生成的核苷称脱氧核糖核苷，参与DNA组成。D
‑
核糖与腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶或尿嘧啶缩合生成相应的腺嘌呤核糖核苷、鸟嘌呤核糖核苷、胞嘧啶核糖核苷、胸腺嘧啶核糖核苷和尿嘧啶核糖核苷，它们分别简称为腺苷(A)、鸟苷(G)、胞苷(C)、胸苷(T)和尿苷(U)。
[0003]鸟苷和肌苷在食品和医药行业有着广泛用途。在食品领域，鸟苷和肌苷分别是鸟苷酸二钠和肌苷酸二钠的重要前体，而鸟苷酸二钠与肌苷酸二钠组合使用作为食品增鲜剂，广泛应用于鸡精、酱油等调味品中。在医药领域，鸟苷和肌苷可作为多种抗病毒药物的医药中间体，如无环鸟苷、三氮唑核苷、三磷酸鸟苷钠等都需要鸟苷作为合成原料。肌苷是肌苷酸的重要前体，而肌苷酸可作为合成腺苷酸(AMP)和鸟苷酸(GMP)的前体，适用于各种原因引起的白细胞减少症、血小板减少症、各种心脏疾患、急性及慢性肝炎、肝硬化等，此外还可治疗中心视网膜炎、视神经萎缩等。
[0004]目前，微生物发酵是生产核苷的主要方法，主要使用的微生物包括枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌等。在生长菌株的选育与改造过程中，通过使用紫外诱变、化学诱变(如硫酸二乙酯)育种，定向选育核苷高产菌株；或者根据细菌中核苷酸的代谢路径和调节机理，深入了解菌株遗传背景及菌株特性，通过代谢工程手段，有目的性地对菌株进行改造，以获得性状优良、能够高产核苷的生产菌株。但目前核苷菌种的发酵性能仍较差、核苷的转化率仍较低，不能满足大规模工业化生产的需求。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供L
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苏氨酸3
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脱氢酶和尿嘧啶透过酶突变体及其应用。
[0006]本专利技术的另一目的是提供产核苷及核苷衍生物的基因工程菌及其构建方法与应用。
[0007]专利技术人意外地发现，经过修饰芽孢杆菌(如枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌)的L
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苏氨酸3
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脱氢酶(由tdh基因编码)和/或尿嘧啶透过酶(由pyrP基因编码)，使得微生物能够高效率地生成腺苷或肌苷，并且成功构建出能够高效生产核苷的新微生物，从而完成本专利技术。
[0008]为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种L
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苏氨酸3
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脱氢酶突变体，所述突变体包含L
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苏氨酸3
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脱氢酶第282位氨基酸由V到除V之外的其他氨基酸的突变，优选由V
到E、A或G的突变。
[0009]本专利技术中，L
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苏氨酸3
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脱氢酶在NCBI上的参考序列编号为WP_003244880.1。
[0010]第二方面，本专利技术提供一种尿嘧啶透过酶突变体，所述突变体包含尿嘧啶透过酶第283位氨基酸由V到除V之外的其他氨基酸的突变，优选由V到M、A或L的突变。
[0011]本专利技术中，尿嘧啶透过酶在NCBI上的参考序列编号为WP_003221479.1。
[0012]第三方面，本专利技术提供编码所述L
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苏氨酸3
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脱氢酶突变体和/或所述尿嘧啶透过酶突变体的核酸分子。
[0013]第四方面，本专利技术提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。
[0014]第五方面，本专利技术提供所述核酸分子或含有所述核酸分子的生物材料的以下任一应用：
[0015](1)用于核苷及核苷衍生物的发酵生产；
[0016](2)用于构建产核苷及核苷衍生物的基因工程菌。
[0017]优选地，所述核苷为腺苷或肌苷。
[0018]第六方面，本专利技术提供产核苷及核苷衍生物的基因工程菌的构建方法，所述方法选自
①
～
③
中的任一种：
[0019]①
利用基因工程手段，在具有核苷生产能力的细菌基因组中引入突变，使其编码的L
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苏氨酸3
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脱氢酶包含V282E、V282A或V282G突变位点；
[0020]②
利用基因工程手段，在具有核苷生产能力的细菌基因组中引入突变，使其编码的尿嘧啶透过酶包含V283M、V283A或V283L突变位点；
[0021]③
利用基因工程手段，在具有核苷生产能力的细菌基因组中引入突变，使其编码的L
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苏氨酸3
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脱氢酶包含V282E、V282A或V282G突变位点，同时，其编码的尿嘧啶透过酶包含V283M、V283A或V283L突变位点。
[0022]本专利技术中，所述细菌为芽孢杆菌属(Bacillus)菌种，如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)或短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)等，优选枯草芽孢杆菌A1(Bacillus.subtilis A1，简称菌株A1，参见CN110257315B)。
[0023]第七方面，本专利技术提供按照所述方法构建得到的基因工程菌。
[0024]第八方面，本专利技术提供所述基因工程菌的以下任一应用：
[0025]1)用于核苷及核苷衍生物的发酵生产；
[0026]2)用于提高核苷及核苷衍生物的发酵产量。
[0027]优选地，所述核苷为腺苷或肌苷。
[0028]借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：
[0029]L
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苏氨酸3
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脱氢酶第282位氨基酸由缬氨酸(V)突变为其他氨基酸，如谷氨酸(E)、丙氨酸(A)或甘氨酸(G)后，腺苷和肌苷产量均有提升，尤其以缬氨酸(V)突变为谷氨酸(E)后效果最好。L
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苏氨酸3
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脱氢酶突变菌株tdh
V282E
与出发菌株A1相比，腺苷产量由1.3g/L提高到1.8g/L，肌苷产量由0.5g/L提高到0.9g/L。
[0030]尿嘧啶透过酶第283位氨基酸由缬氨酸(V)突变为其他氨基酸，如蛋氨酸(M)、丙氨酸(A)或亮氨酸(L)后，检测到腺苷和肌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.L
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苏氨酸3
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脱氢酶突变体，其特征在于，所述突变体包含L
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苏氨酸3
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脱氢酶第282位氨基酸由V到除V之外的其他氨基酸的突变，优选由V到E、A或G的突变；其中，L
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苏氨酸3
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脱氢酶在NCBI上的参考序列编号为WP_003244880.1。2.尿嘧啶透过酶突变体，其特征在于，所述突变体包含尿嘧啶透过酶第283位氨基酸由V到除V之外的其他氨基酸的突变，优选由V到M、A或L的突变；其中，尿嘧啶透过酶在NCBI上的参考序列编号为WP_003221479.1。3.编码权利要求1所述L
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苏氨酸3
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脱氢酶突变体和/或权利要求2所述尿嘧啶透过酶突变体的核酸分子。4.含有权利要求3所述核酸分子的生物材料，所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。5.权利要求3所述核酸分子或权利要求4所述生物材料的以下任一应用：(1)用于核苷及核苷衍生物的发酵生产；(2)用于构建产核苷及核苷衍生物的基因工程菌；优选地，所述核苷为腺苷或肌苷。6.产核苷及核苷衍生物的基因工程菌的构建方法，其特征在于，所述方法选自
①
～
③
中的任一种：
①
利用基因工程手段，在具有核苷生产能力的细菌基因组中引入突变，使其编码的L
...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴涛，薛婷莉，栾明月，姚佳琪，胡丹，齐丹丹，赵津津，李岩，
申请(专利权)人：廊坊梅花生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：