一种葡萄糖脱氢酶突变体及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种葡萄糖脱氢酶突变体，能够应用于氧化还原反应中辅酶NADH以及NADPH的再生。该葡萄糖脱氢酶突变体的活力是野生型葡萄糖脱氢酶的活力的7.2倍，提高了催化辅酶再生的能力，更适于工业化应用。更适于工业化应用。

【技术实现步骤摘要】
一种葡萄糖脱氢酶突变体及应用

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[0001]本专利技术属于酶基因工程
，具体涉及一种高活力催化辅酶再生的葡 萄糖脱氢酶突变体及应用。

技术介绍
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[0002]氧化还原酶被广泛应用于催化制备手性醇、羟基酸等药物中间体，绝大多 数氧化还原反应都需要辅酶NAD(P)H的参与。因辅酶价格昂贵，稳定性差、难 以重复利用，严重限制了氧化还原酶的工业化应用，构建高效、经济的辅酶再 生体系对于解除辅酶含量对反应的限制、降低生产成本极为重要。
[0003]葡萄糖脱氢酶(GDH)是一类能催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸内酯的氧化 还原酶，催化过程中可以提供氢离子，因此在辅酶的再生体系中有着重要的应 用价值。
[0004]葡萄糖脱氢酶根据其所结合的辅酶可分为三种类型：吡咯喹啉醌依赖型、 FAD依赖型及NAD(P)
+
依赖型。其中NAD(P)
+
依赖型葡萄糖脱氢酶可特异性催 化β
‑
D
‑
葡萄糖生成葡萄糖酸内酯，见图1，同时将NAD(P)
+
转化为NAD(P)H， 从而解决NADH以及更为昂贵的NADPH的再生问题。由于其对辅酶NAD(P)
+
的比活高，对还原性辅酶NAD(P)H的再生能力强，且既可用于NADH的再生， 又可用于NADPH的再生，NAD(P)
+
依赖型葡萄糖脱氢酶得到了广泛的应用。
[0005][0006]当前的葡萄糖脱氢酶的催化能力比较弱，在工业化应用中成本比较高，而 且会增加后期的环保处理压力，为了提升葡萄糖脱氢酶的催化效率，可以利用 蛋白质工程手段，对葡萄糖脱氢酶进行基因改造。

技术实现思路
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[0007]本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种高活力催化辅酶再生能 力的葡萄糖脱氢酶突变体。
[0008]一方面，本专利技术提供的葡萄糖脱氢酶突变体的氨基酸序列是以SEQ ID NO.2 所示的野生型葡萄糖脱氢酶为参考序列发生突变的氨基酸序列，突变位点为88 位的缬氨酸突变为异亮氨酸(V88I)，165位的异亮氨酸突变为甘氨酸(I165G)， 190位的丙氨酸突变为丝氨酸(A190S)，197位的丙氨酸突变为蛋氨酸(A197M)， 205位的谷氨酰胺突变为甘氨酸(Q205G)，214位的脯氨酸突变体精氨酸(P214R) 和252位的谷氨酰胺突变为亮氨酸(Q252L)。
[0009]进一步，所述葡萄糖脱氢酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0010]进一步，所述葡萄糖脱氢酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0011]进一步，所述葡萄糖脱氢酶突变体的野生型基因序列来源于枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)，野生型模板NCBI的登录号为WP_119899028.1。
[0012]更进一步，葡萄糖脱氢酶突变体表达于基因工程菌，优选大肠杆菌或酵母 菌。
[0013]另一方面，本专利技术提供的葡萄糖脱氢酶突变体可以应用于氧化还原反应中 辅酶NADH以及NADPH的再生。
[0014]进一步，所述葡萄糖脱氢酶突变体为葡萄糖脱氢酶酶粉或含有该葡萄糖脱 氢酶的全细胞或细胞破碎液。
[0015]本专利技术的有益效果在于，本专利技术利用蛋白质工程方法改造出一种新的葡萄 糖脱氢酶突变体，该葡萄糖脱氢酶突变体的活力是野生型葡萄糖脱氢酶的活力 的7.2倍，提高了催化辅酶再生的能力，更适于工业化应用。
附图说明
[0016]图1实施例1中核酸电泳图
[0017]图2实施例2中破碎细胞电泳图
[0018]图3实施例3中饱和引物能够扩增出清晰的基因条带电泳图
具体实施方式
[0019]下面结合具体实施例对本专利技术的
技术实现思路
作进一步的阐述，其目的是为了 更好的理解本专利技术的内容，但本专利技术的保护范围不限于此。
[0020]实施例1：野生型葡萄糖脱氢酶的工程菌构建
[0021]从NCBI收录的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis的信息中，挖掘到葡萄糖脱氢 酶的基因序列(WP_119899028.1)，通过人工全合成技术完成基因片段的体外合 成，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。将该基因引入到pET
‑
21a的多克隆位 点区域，转入到大肠杆菌BL21(DE3)受体菌中，在含有Amp
+
抗性的LB平板上， 利用通用引物(T7/T7TER)鉴定出阳性克隆，转到LB培养基中活化，用于后 期表达研究。
[0022]PCR扩增鉴定基因的引物信息为：
[0023]T7
‑
FTAATACGACTCACTATAGGGT7
‑
ter
‑
RTGCTAGTTATTGCTCAGCGG
[0024]PCR扩增的体系为：
[0025]PCR mixtureConcentrationVolumeddH2O(灭过菌)/73μLDream Taq buffer10X10μLT7/T7
‑
ter10μM4μL/个Template/1uLdNTP mix2.5mM8μLDream Taq/1μLTotal volume 100μL
[0026]扩增结果显示所挑选的单克隆都为阳性，具体核酸电泳图见图1。
[0027]实施例2：野生型葡萄糖脱氢酶的蛋白表达
[0028]将筛选到的阳性克隆转入含有Amp
+
抗性的LB试管中，37℃下培养过夜。 将种子液按照1.5％的接种量转接到含有Amp
+
抗性的2YT培养基中，在37℃下 培养细菌，待生物量OD
600
值达到0.6左右，进行IPTG诱导，温度降低到25℃， 表达16h后收集菌体，并破碎细胞进行电泳分析，结果见图2，蛋白的大小和 预期的一致，且有很好的可溶性表达。
[0029]实施例3：葡萄糖脱氢酶突变体的构建和筛选
[0030]根据对野生型葡萄糖脱氢酶结构的模拟和文献的支持，对蛋白结构中热点 的氨基酸：V88、I165、A190、A197、Q205、P214和Q252进行半理性设计， 完成饱和突变库的构建。具体饱和突变体引物见下表，突变位点的氨基酸全部 采用NNK/NNM来设计。利用PCR快速扩增技术，在饱和引物的指引下完成全 质粒扩增，每个位点筛选200个单克隆左右，使得突变率覆盖到95％以上。利 用每个突变体转化后生成的辅酶(NADPH)的量，在340nm下筛选出高活性 的突变体，在不同位点的迭代饱和突变下，最后筛选达到活性提升7.2倍的高突 变株Mut(V88I/I165G/A190S/A197M/Q205G/P214R/Q252L)，突变体Mut中涉及 到7个位点都发生了突变，且突变后蛋白表达没有受到影响。
[0031][0032][0033]全质粒扩增采用Prime STAR Max聚合酶的高效能力，在本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种葡萄糖脱氢酶突变体，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶突变体氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。2.如权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶突变体，其特征在于，所述葡萄糖脱氢酶突变体的基因核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。3.如权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶突变体，其特征在于，所述葡萄...

【专利技术属性】
技术研发人员：竺伟，张小飞，
申请(专利权)人：尚科生物医药上海有限公司，
类型：发明
国别省市：