用于表征MHCI肽结合的测定和试剂制造技术

本公开涉及制备以及检测MHCI/配体肽复合物的试剂和方法。物的试剂和方法。物的试剂和方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于表征MHCI肽结合的测定和试剂
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年8月25日提交的第63/070,211号、2020年9月29日提交的第63/085,113号以及2021年7月2日提交的第63/218,073号美国临时申请的优先权，其出于所有目的通过引用整体并入本文。
[0003]序列表
[0004]本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式以电子方式提交，并通过引用整体并入本文。该ASCII副本创建于2021年8月19日，命名为048893
‑
533001WO_ST25.txt，并且大小为13,352位元组。


[0005]本申请涉及用于分析主要组织相容性I类(MHCI)复合物的系统和方法。可使用非变性质谱分析、酶联免疫吸附测定(ELISA)、时间分辨荧光共振能量转移(TR
‑
FRET)光谱进行分析，任选地结合经由尺寸排阻色谱法或毛细管电泳(例如毛细管区带电泳)的MHCI复合物分离。在一些实施例中，这些方法应用于肽交换的MHCI复合物，例如，使用预期存在于患者样品中的肽。

技术介绍

[0006]主要组织相容性复合物
‑
I(MHCI)是一种几乎广泛存在的蛋白复合物，其负责将抗原提呈细胞表面上的自身和外源来源的展示肽呈递至淋巴细胞。通过MHCI的展示肽呈递是后天免疫应答朝破坏病变细胞或保护健康细胞的第一步。MHCI复合物是一种非共价连接的蛋白异二聚体，其由重链(α)和轻链(β2微球蛋白，B2M)组成；一般而言，MHCI复合物在没有8
‑
11个残基展示肽配体的情况下是不稳定的。锥状展示肽生成路径利用将泛素化的细胞质蛋白降解成潜在展示肽的蛋白酶体。这些展示肽随后被输入至内质网中，在那里其被进一步改质(refine)，并且活性MHCI/展示肽复合物在运送至细胞表面以呈递至细胞毒性或CD8(+)T细胞前，经由蛋白质伴护蛋白(chaperone)辅助过程形成，以识别并确定细胞命运。
[0007]MHCI蛋白由主要组织相容性复合物基因复合物编码，并且也被称为人类白细胞抗原(HLA)系统的成员。虽然总共有大约24个已知的MHCI家族成员，但是最常见的MHCI家族成员由HLA
‑
A、HLA
‑
B和HLA
‑
C基因座编码。每个HLA组包含至少几十个或更多个等位基因，并且这些等位基因的差异表达导致蛋白输出的丰富多样性。实际上，有>20,000种不同的HLA
‑
A、HLA
‑
B和HLA
‑
C蛋白复合物，每种都具有自己的稳定性和典型的配体特异性。MHCI蛋白系统的高度多样性使整个系统能够识别大量可能的抗原，包括源自非人来源的肽、转译后修饰的自身肽和体外合成的肽。
[0008]治疗规避性免疫标靶的目的发展领域涉及生成用于表征患者中的CD8(+)T细胞依赖性应答的先前未经表征的、未知的或经设计的抗原(包括新抗原肽序列)。然而，缺乏可用于生产、选择和鉴定体外最佳MHCI复合物:抗原(包括新抗原)结合的稳固、高通量方法。

技术实现思路

[0009]本申请提供了用于测定用于广范围免疫疗法的MHCI肽的组合物和方法。
[0010]本文描述了一种快速、高通量、多重监测测定法，以寻找潜在的新抗原肽，其可能呈递在患者的MHCI分子上并且可与T细胞结合，并且可有助于为癌症患者开发适当的治疗。诸如ELISA(酶联免疫吸附测定)、TR
‑
FRET(时间分辨荧光共振能量转移)和2D
‑
LC
‑
MS(二维液相色谱质谱法)等测定法可用于分析MHCI
‑
肽复合物。色谱法(诸如2D
‑
LC)可与质谱法(MS)结合进行检测。
[0011]本文所描述的方法和系统利用非变性质谱分析表征与肽结合的MHCI复合物。在一些实施例中，在进行非变性质谱分析前，先进行尺寸排阻色谱法(SEC)或在其他情况下先进行毛细管电泳(CE)，例如毛细管区带电泳(CZE)。在一些情况下，非变性质谱分析允许表征与MHCI结合的肽，并证实特定肽与MHCI复合物为非共价结合。在一些情况下，相较于色谱法(诸如SEC)，CE还可允许用于检测以较低浓度存在的结合肽。在一些情况下，例如与2D
‑
LC
‑
MS方法中的二维分离相比，仅以SEC、CE或CZE进行单次色谱法分离，然后进行非变性质谱分析。在一些实施例中，与其他分析技术相比较，本文的方法还可提供增加的通量。
[0012]在一方面，本文提供了一种主要组织相容性复合物I类(MHCI)蛋白复合物，其包括α链、β链和配体，该配体包含非天然UV可裂解氨基酸。
[0013]在一方面，本文提供了一种肽交换分析法，其通过提供包含测试肽和MHCI/配体复合物的第一组合物，以确定MHCI等位基因与测试肽的结合，该MHCI/配体复合物包括(i)包含α链、β链的MHCI分子和(ii)配体，其中该配体为包含非天然紫外线(UV)可裂解氨基酸的肽；将该第一组合物暴露于UV光，以在UV可裂解氨基酸处裂解该配体；以及将该第一组合物孵育一段时间以形成包含游离测试肽、该α链、该β链和/或MHCI/
‑
第二肽复合物的第二组合物；并确定该MHCI等位基因是否与该第二肽结合。
[0014]在一方面，本文提供了一种用于确定最佳MHCI等位基因
‑
配体组合的方法，该方法涉及：提供在变性条件下纯化的多个MHCIα链单体，通过合并该多个MHCIα链单体、多个β链单体以及含有非天然UV可裂解氨基酸的配体，以形成反应混合物，在允许形成MHCI
‑
配体复合物的条件下孵育该反应混合物，并确定是否形成该MHCI
‑
配体复合物。
[0015]在一方面，本文提供了一种用于检测MHCI等位基因与测试肽的结合的方法，该方法涉及：提供包括测试肽和MHCI/配体复合物的第一复合物，其包括含有α链、β链的MHCI分子和配体，其中该配体为包括非天然、紫外线(UV)可裂解氨基酸的肽，然后将该第一复合物暴露于UV光下，以在UV可裂解氨基酸处裂解该配体，并检测该第二复合物中的MHCI/测试肽复合物，从而检测该MHCI分子与该测试肽的结合。
[0016]在一方面，本文提供了一种鉴定MHCI结合配体的方法，该方法包括在允许形成MHCI/配体复合物的条件下，将多个MHCI等位基因链单体与多个β链单体和配体接触，其中该配体为含有非天然UV可裂解氨基酸的肽，并检测该MHCI/配体复合物，从而鉴定MHCI结合配体。
[0017]在一方面，本文提供了一种用于确定最佳MHCI等位基因
‑
配体组合的方法，该方法涉及：提供在变性条件下所纯化的多个MHCIα链单体，通过合并该多个MHCIα链单体、多个β链单体以及含有非天然UV可裂解氨基酸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种主要组织相容性复合物I类(MHCI)/配体复合物，其包含(i)含有α链、β链的MHCI分子和(ii)配体，其中所述配体为包含非天然UV
‑
可裂解氨基酸的肽。2.根据权利要求1所述的MHCI/配体复合物，其中所述α链为由下列基因座中的任一者编码的α链：HLA
‑
A、HLA
‑
B或HLA
‑
C。3.根据权利要求1所述的MHCI/配体复合物，其中所述配体的长度在8个与11个氨基酸之间。4.根据权利要求3所述的MHCI/配体复合物，其中所述配体的长度为8个氨基酸。5.根据权利要求3所述的MHCI/配体复合物，其中所述配体的长度为9个氨基酸。6.根据权利要求3所述的MHCI/配体复合物，其中所述配体的长度为10个氨基酸。7.根据权利要求3所述的MHCI/配体复合物，其中所述配体的长度为11个氨基酸。8.根据权利要求1至7中任一项所述的MHCI/配体复合物，其中所述UV
‑
可裂解氨基酸。9.根据权利要求8所述的MHCI/配体复合物，其中所述UV
‑
可裂解氨基酸选自：2
‑
硝基苯基甘氨酸(NPG)、扩展邻
‑
硝基苄基接头、邻
‑
硝基苄基笼型酚、邻
‑
硝基苄基笼型硫醇、32硝基藜芦基氧基羰基(NVOC)笼型苯胺、邻
‑
硝基苄基笼型硒化物、双
‑
偶氮苯、香豆素、肉桂基、螺吡喃、2
‑
硝基苯基丙氨酸(2
‑
nF)和3
‑
氨基
‑3‑
(2
‑
硝基苯基)丙酸(ANP)氨基酸类似物。10.根据权利要求9所述的MHCI/配体复合物，其中所述UV
‑
可裂解氨基酸包括3
‑
氨基
‑3‑
(2
‑
硝基苯基)
‑
丙酸酯(ANP)氨基酸类似物。11.根据权利要求1至10中任一项所述的MHCI/配体复合物，其中所述UV
‑
可裂解氨基酸在所述配体内的任何位置。12.根据权利要求1至11所述的MHCI/配体复合物，其中所述配体包含SEQ ID NO.：1至SEQ ID NO.：34中的任一者的氨基酸序列。13.根据权利要求1至12中任一项所述的MHCI/配体复合物，其中所述α链和所述配体包含HLA等位基因和氨基酸序列的下列组合中的任一者：等位基因序列A*02：03FMYJDFHFIA*02：06FLPJDFFPSVA*02：07FLPSDJFPSVA*23：01FYIQMJTELA*26：01YVIJDLAAMA*29：02HFFJWGTMFA*30：01AVVSLJRLLKA*30：02GTHJLLPFYA*31：01AMLTAJFLRA*32：01HLMFYJLPIA*68：01QLFJFSPRRA*68：02TJFFYRYGFVB*18：01DEFJPIVQYB*35：03TPAJYFHVLB*40：01RESFGJESF
B*40：02AENJYVTVFB*40：06KEVLVLWJIB*46：01FMYEGJTPLB*51：01FPFJLAAIIB*53：01FPIPSJWAFB*57：01ITAAAWYJWB*58：01LAVMGJAAWC*01：02HLPJGVKSLC*02：02FAAEAJKLC*03：02GAINSJLPYC*03：03FAIVPJLQIC*05：01FAMJVPLLIC*06：02ARFJDLRFVC*07：01ANNJRLWVYC*08：01YAAJTNFLLC*08：02lSDSAJNMMC*12：03WAWJFAAVLC*14：02MMHJSTSPFC*15：02RTFGQJLFF。14.一种用于确定主要组织相容性复合物I类(MHCI)等位基因与测试肽的结合的肽交换测定，其包括：(a)提供包含测试肽和MHCI/配体复合物的第一组合物，所述MHCI/配体复合物包含(i)含有α链、β链的MHCI分子和(ii)配体，其中所述配体为包含非天然紫外线(UV)
‑
可裂解氨基酸的肽；(b)将所述第一组合物暴露于UV光以在所述UV
‑
可裂解氨基酸处裂解所述配体；以及(c)将所述第一组合物孵育一定时间段以形成包含游离测试肽、所述α链、所述β链和/或MHCI/
‑
第二肽复合物的第二组合物；以及(d)确定所述MHCI等位基因是否与所述第二肽结合。15.根据权利要求14所述的肽交换测定，其中通过测量所述第二组合物中的MHCI/肽复合物的水平来确定MHCI等位基因与所述肽的结合。16.根据权利要求15所述的肽交换测定，其中通过所述第二组合物的2维液相色谱
‑
质谱(2D LC/MS)来测量MHCI/第二肽复合物的水平。17.根据权利要求16所述的肽交换测定，其中2D LC/MS包括从所述第二组合物去除游离第二肽。18.根据权利要求14至17中任一项所述的肽交换测定，其进一步包括进行高效液相色谱(HPLC)和质谱(MS)以区分所述MHCI和所述第二肽。19.根据权利要求14至18中任一项所述的肽交换测定，其中通过经由尺寸排阻色谱的分离从所述第二组合物去除所述游离第二肽。
20.根据权利要求18或19所述的肽交换测定，其中如通过HPLC和MS所确定的所述第二肽的存在指示所述MHCI能够与所述第二肽结合。21.根据权利要求14至20中任一项所述的肽交换测定，其中将多个所述MHCI/配体复合物与至少两种不同测试肽进行组合。22.根据权利要求21所述的肽交换测定，其中所述测试肽通过质谱基于每种肽的预测质量来进行鉴定。23.根据权利要求14至22中任一项所述的肽交换测定，其中所述测试肽以至少10:1(测试肽:MHCI)的比率存在于所述第一组合物中。24.根据权利要求14至23中任一项所述的肽交换测定，其中所述MHCI/配体复合物为根据权利要求1至13中任一项所述的MHCI/配体复合物。25.根据权利要求14至24中任一项所述的肽交换测定，其中所述MHCI/肽复合物进一步包含第一标记物，由此形成经标记的MHCI/肽复合物。26.根据权利要求25所述的肽交换测定，其中通过以下来确定肽交换的水平：(a)使经标记的MHCI/配体肽复合物与以下接触：(i)抗体复合物，其包含共价连接至荧光共振能量转移(FRET)受体的抗MHCI等位基因抗体；和(ii)FRET发射体复合物，其包含与第二标记物缀合的FRET发射体，由此形成反应组合物；(b)检测所述反应组合物中的所述第二标记物的FRET发射，由此检测MHCI等位基因与肽的结合。27.根据权利要求26所述的肽交换测定，其中将所述反应组合物孵育至少约10小时。28.根据权利要求26所述的肽交换测定，其中将所述组合物孵育至少约15小时。29.根据权利要求26至28中任一项所述的肽交换测定，其中所述第一标记物为链霉亲和素。30.根据权利要求26至28中任一项所述的肽交换测定，其中所述抗MHCI等位基因抗体包含抗HLA抗体、单体或部分抗体。31.根据权利要求29所述的肽交换测定，其中所述第二标记物为生物素。32.根据权利要求26至28中任一项所述的肽交换测定，其中所述第一标记物为生物素。33.根据权利要求32所述的肽交换测定，其中所述第二标记物为链霉亲和素。34.根据权利要求26至33中任一项所述的肽交换测定，其中来自所述FRET受体的发射指示所述测试肽与所述MHCI的结合。35.根据权利要求26至34中任一项所述的肽交换测定，其中所述MHCI与所述测试肽的结合通过第二肽交换测定来证实。36.根据权利要求35所述的肽交换测定，其中所述第二肽交换测定为根据权利要求15至16中任一项所述的肽交换测定。37.根据权利要求26至35中任一项所述的肽交换测定，其中通过TR
‑
FRET来确定与所述MHCI分子结合的测试肽的量。38.一种检测主要组织相容性复合物I类(MHCI)等位基因与测试肽的结合的方法，所述方法包括：
(a)提供包含测试肽和MHCI/配体复合物的第一组合物，所述MHCI/配体复合物包含(i)含有α链、β链的MHCI分子和(ii)配体，其中所述配体为包含非天然紫外线(UV)
‑
可裂解氨基酸的肽；(b)将所述第一组合物暴露于UV光以在所述UV
‑
可裂解氨基酸处裂解所述配体；以及(c)检测所述第二组合物中的MHCI/测试肽复合物，由此检测所述MHCI分子与所述测试肽的结合。39.根据权利要求38所述的方法，其中(c)中的所述检测包括检测MHCI/肽复合物相对于对照的水平。40.根据权利要求39所述的方法，其中通过2维液相色谱
‑
质谱(2DLC/MS)来检测所述MHCI/测试肽复合物的水平。41.根据权利要求40所述的方法，其中所述第二组合物在适用于2DLC/MS的器皿中。42.根据权利要求38至41中任一项所述的方法，其中从所述第二组合物去除所述游离测试肽。43.根据权利要求42所述的方法，其中通过尺寸排阻色谱从所述第二组合物去除所述游离测试肽。44.根据权利要求38至43中任一项所述的方法，其中(c)中的所述检测进一步包括高效液相色谱(HPLC)和质谱(MS)以区分所述MHCI分子和所述测试肽。45.一种鉴定MHCI结合配体的方法；所述方法包括：(a)使多个MHCIα链单体与多个β链单体和配体在允许形成MHCI/配体复合物的条件下接触，其中所述配体为包含非天然UV
‑
可裂解氨基酸的肽；以及(b)检测所述MHCI/配体复合物，由此鉴定MHCI结...

【专利技术属性】
技术研发人员：李娟，W，
申请(专利权)人：基因泰克公司，
类型：发明
国别省市：