糖基功能化细菌毒素分子印迹膜基片及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种糖基功能化细菌毒素分子印迹膜基片及其制备方法和应用。所述分子印迹膜基片是以糖基功能化细菌毒素分子印迹聚合物作为识别元件在所述金石英晶体基片表面形成反应层；其制备方法为：选择能与细菌毒素特异性识别并能够合成相应分子印迹聚合物的糖分子功能单体；制备糖基功能化分子印迹聚合物溶液；利用基片表面修饰技术，将糖基功能化分子印迹聚合物修饰到金石英晶体基片表面，形成反应层。将按上述方法制得的糖基功能化分子印迹膜基片连接到压电石英晶体微天平，可对环境样品提取液中的细菌毒素进行检测。本发明专利技术的分子印迹膜基片具有良好的分子识别性能，大大提高了检测细菌毒素的灵敏度和选择性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种糖基功能化细菌毒素分子印迹膜基片及其制备方法和应用，属于分析化学

技术介绍
许多细菌病原体合成的细菌毒素是致病的首要因素。这种产生细菌毒素的能力是许多细菌病原体致病的潜在机制。细菌毒素主要有三种外毒素、内毒素和非蛋白毒素。外毒素是一种典型的水溶性蛋白，是细菌在指数生长期分泌的已知可感染人类毒性最强的细菌毒素，在很低浓度时就具有很高的毒性。其中霍乱毒素的致病机理是通过找到作为细胞识别物-G蛋白，然后把一个ADP分子结合上去。这就把G蛋白转换到一种持续激活的状态，使其发出一个无休止的信号，使得细胞被这些信号迷惑，在进行其他生命活动的同时，开始将大量的水分子和钠离子运输到细胞外，超过了肠道的再吸收能力而导致危及生命的脱水症状。志贺毒素具有神经毒素、细胞毒素和肠毒素三种生物活性，神经毒性作用于中枢神经系统，引起四肢麻痹、死亡；细胞毒性对人肝细胞、猴肾细胞和HeLa细胞均有毒性；肠毒性具有类似大肠杆菌、霍乱弧菌肠毒素的活性，可以解释疾病早期出现的水样腹泻。大多数毒素是多价态的，它可与宿主细胞膜上特殊的糖蛋白受体结合，作为初始识别与结合位点。通过研究细菌毒素的性质及其侵入宿主细胞的机制，发现糖类化合物在这种作用中发挥着主要作用，其与细菌毒素的相互作用并不是简单的单体结合，而是寡或多糖作用机制，因此采用糖类结构的受体分子检测病原体是非常有利的。但是，许多其他的内源性和外源性蛋白也能识别到糖类碳水化合物，从而导致假阳性结果，因此，单纯依赖糖类化合物与细菌毒素的结合机制检测病毒，其选择性还不能满足实际需要，还需其他特异性识别手段作为辅助。分子印迹合成是在材料中特定识别位点的模板诱导合成技术，通过自组装方式由模板指导分子结构的定位。材料本身可能是低聚物(如DNA复制过程)、多聚体(有机分子印迹化合物，无机印迹硅胶)或具有二维结构的聚合物(表面接枝单层膜)。在分子印迹技术中，以模板分子作为模板，单体通过相互作用并交联在其周围，共聚形成核壳结构聚合物。此时单体和模板通过共价或非共价作用形成一个主客体复合物，当采用适当方法洗去模板分子之后，高分子聚合物就留下一个与印迹分子空间结构完全匹配，并含有能与印迹分子专一结合的三维空穴。聚合物上留下分子印迹使其可以选择性地重新吸附模板分子，从而使分子印迹聚合物拥有生物受体的两个重要特征一一识别和吸附特异靶分子的能力。二十世纪分子印迹已经取得长足的发展。分子印迹聚合物(MIPs)已成功应用于生物医药、食品、环境监测，以及通过亲和固相提取进行样品制备等领域。由于分子印迹聚合物与抗体和酶等生物分子受体相比具有高稳定性和低成本的特点，因此，还可以在化学传感器和生物传感器中作为识别分子，而且当天然受体不存在或难以得到时，还可以对分子印迹聚合物复合物进行有针对性的修饰。近年来，分子印迹聚合物在细菌毒素、糖类以及蛋白质印迹方面的研究明显增加。利用高效液相色谱对比印迹和非印迹聚合物分子的分离能力的实验，可以证实分子印迹聚合物对生物分子的选择性识别作用。Ratner用射频辉光放电等离子沉积法制备了聚合物薄膜修饰的包覆有二聚糖的蛋白质。二聚糖与高分子膜共价相连，形成一个类似多糖的空穴，对多种蛋白质包括清蛋白，免疫球蛋白，溶解酵素，核糖核酸酶和链锁状球菌具有很高的选择性识别能力。但是这种制备方法很难直接应用于大多数传感器的金基片表面。因此，开发一种快速、 一步检测细菌毒素的检测系统显得越来越重要。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供了一种检测速度快、灵敏度高的糖基功能化细菌毒素分子印迹膜基片。本专利技术还提供了上述糖基功能化细菌毒素分子印迹膜基片的制备方法以及利用其进行细菌毒素检测的方法。本专利技术是通过以下技术方案实现的5所述的糖基功能化细菌毒素分子印迹膜基片，包括金石英晶体基片，其特征在于: 以糖基功能化细菌毒素分子印迹聚合物作为识别元件在所述金石英晶体基片表面形成 反应层；所述糖基功能化细菌毒素分子印迹聚合物是将细菌毒素模板分子、糖分子功能单体、交联剂、致孔剂、引发剂和有机溶剂按摩尔比为o.i 2 : 2.5 : o.i 5 : 40 80 : o.oi o.io : i.o i5的比例聚合而成。所述糖分子功能单体为A-D-吡喃糖基甘露糖、N-乙酰糖胺、N-乙酰乳糖胺、唾液 酸神经节苷脂或神经酰胺三已糖苷；所述交联剂为三羟甲基丙垸三甲基丙烯酸酯、N， N-亚甲基二丙烯酰胺、N， N-l， 4-亚苯基二丙烯酰胺、3， 5-二 (丙烯酰胺)苯甲酸、 乙二醇二甲基丙烯酸酯、二乙烯基苯、N， O-二丙烯酰-L-苯丙胺醇、季戊四醇三丙烯 酸酯或季戊四醇四丙烯酸酯；所述引发剂为偶氮二异丁腈；所述致孔剂为二氯甲烷、 氯仿、乙腈、甲醇、异丙醇、四氯化碳、N，N-二甲基酰胺或二甲基亚砜；所述有机溶 剂为二氯甲烷或四氯化碳。上述糖基功能化细菌毒素分子印迹膜基片的制备方法包括以下步骤(1) 选择能与细菌毒素特异性识别并能够合成相应分子印迹聚合物的糖分子功能单 体；(2) 将细菌毒素模板分子、糖分子功能单体、交联剂、致孔剂、引发剂和有机溶剂按摩尔比=0.1 2 : 2.5 : o.i 5: 40 80 : o.oi o.io : 1.0 15混合均匀制成糖基功能化分子印迹聚合物溶液；(3) 利用基片表面修饰技术，将糖基功能化分子印迹聚合物修饰到金石英晶体基片表 面，形成反应层。其中，将糖基功能化分子印迹聚合物修饰到金石英晶体基片表面包括以下步骤(1) 将金石英晶体基片用去离子水清洗，再用纯甲醇浸泡l-3小时，然后用去离子水 冲洗3-5遍，再用超声波清洗3-5min,晾干；(2) 将晾干的金石英晶体基片浸泡于糖基功能化分子印迹聚合物溶液中5-10min取出， 用洗脱剂洗脱20-30min，在室温下干燥5-10min;(3) 重复歩骤(2)的过程4-7次，制得所述糖基功能化分子印迹膜基片。为使基片达到更好的性能，上述制备方法还包括以下步骤将制得的糖基功能化 分子印迹膜基片浸入pH6.8-7.5的缓冲液，保存在4。C冰箱，12 24h后使用。所述洗脱剂为乙腈、水、甲醇-乙酸或乙腈-乙酸；所述缓冲液为柠檬酸-磷酸溶液。利用上述糖基功能化细菌毒素分子印迹膜基片进行细菌毒素检测的方法包括以下 步骤将按上述任意一种方法制得的糖基功能化分子印迹膜基片连接到压电石英晶体 微天平，对环境样品提取液中的细菌毒素进行检测。利用分子印迹膜基片对细菌毒素进行检测的工作原理为当有物质在石英晶片上 吸附或沉淀时，晶体震荡频率发生变化(AF)，它与晶片上沉积物的质量变化(AM) 间有简单的线性关系。压电石英晶体微天平的金石英晶体基片共振频率的变化AF与 吸附物质量m的关系如下A F—2F。2(pq)xq) — l/2m/A其中Fo为石英基本振动频率，pq为石英的密度二2.65Xl(^kg/m3， U q为剪切模 量二2.95X10^Pa， A为基片表面积。本专利技术中使用的是At-cut基片，石英基本振动频率Fo=9MHz，基片表面积A二0.19 ±0.01 X10"41112，因此可以得到△ F—1.83X 108m/A本专利技术的有益效果1. 本专利技术所开发的糖基功能化细菌毒素分子印迹膜基片制备方法，将糖类与细菌 毒素的特异性识别本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种糖基功能化细菌毒素分子印迹膜基片，包括金石英晶体基片，其特征在于：以糖基功能化细菌毒素分子印迹聚合物作为识别元件在所述金石英晶体基片表面形成反应层；　　　　所述糖基功能化细菌毒素分子印迹聚合物是将细菌毒素模板分子、糖分子功能单体、交联剂、致孔剂、引发剂和有机溶剂按摩尔比为０．１～２∶２．５∶０．１～５∶４０～８０∶０．０１～０．１０∶１．０～１５的比例聚合而成。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄加栋，汪世华，于京华，裴梅山，葛慎光，张秀明，邢宪荣，贺晓蕊，林青，朱晗，孙纳新，宋晓妍，袁靓，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]