2A序列和/或截短的2A序列在TCRαβ单链扩增中的应用制造技术

本申请涉及2A序列和/或截短的2A序列在TCRαβ单链扩增中的应用，并提供了一种扩增TCRαβ单链的方法，通过设计引物在TCRβC区3

【技术实现步骤摘要】
2A序列和/或截短的2A序列在TCR
αβ
单链扩增中的应用


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及2A序列和/或截短的2A序列在TCRαβ单链扩增中的应用。

技术介绍

[0002]将经功能活性验证后的T细胞进行多聚体(multimers)分选和/或T细胞活化表面分子(例如4
‑
1BB)分选是常用的获得抗原特异性TCR的方法。T细胞经单细胞RNA
‑
seq测序方法可获得特异性TCR序列，但此种方法过程较复杂、成本较高。
[0003]T细胞受体(TCR)分子为异源二聚体，由两条肽链α和β或γ和δ组成，其中TCRαβ是我们更关注的。当TCRα/β重组表达载体分别转导入细胞进行外源表达时，由于蛋白表达的时空差异，可能两条肽链的表达量会不一致，由此可能会影响由两者组装形成的TCR二聚体生物学功能发挥的水平。
[0004]为了克服上述缺陷，Spindler M J等人采用液滴包裹单核细胞
→
mRNA捕获
→
一步法RT
‑
PCR
→
两次重组构建完整单链表达载体的TCRV区扩增技术路线。具体地，TCR扩增技术路线可以包括：1.一步法RT
‑
PCR扩增TCR，即在同一反应体系中先后进行逆转录和TCR扩增，获得TCR序列。2.利用微流控技术，液滴包裹单细胞及在液滴中进行PCR扩增，实现了高通量获取TCR序列。
[0005]但Spindler M J等人的研究同样存在如下缺陷：1.一步法RT
‑
PCR扩增TCR，得到的TCRβα单链中TCRβC区是截短的、序列不完整，需在后续载体重组过程中将C区序列补充完整。2.利用微流控技术扩增TCR过程中需要进行液滴包裹单细胞及磁珠捕获mRNA、液滴再次包裹磁珠进行PCR扩增，所涉及的技术基础较多且需要专门的仪器设备，实验过程比较复杂、成本较高。

技术实现思路

[0006]基于此，本申请有必要提供2A序列和/或截短的2A序列在TCRαβ单链扩增中的应用，使TCRαβ单链中的TCRβC区完整，两条肽链表达量一致。
[0007]具体技术方案如下：
[0008]本申请第一方面提供了如下序列在TCRαβ单链扩增中的应用，所述序列包括：
[0009]1)第一2A序列和/或第二2A序列；
[0010]2)第三2A序列；
[0011]其中，第一2A序列和第二2A序列各自独立地选自完整的2A序列或截断的2A序列，所述第三2A序列为第一2A序列或第二2A序列的反向互补序列的至少部分序列。
[0012]在其中一个实施例中，所述2A序列为编码2A肽的核苷酸序列。
[0013]优选地，所述2A肽选自T2A、F2A、E2A或P2A。
[0014]优选地，所述2A肽为T2A。
[0015]在其中一个实施例中，所述截短的2A序列的长度为10
‑
63bp；和/或，所述第三2A序
列的长度为10
‑
64bp，优选为15
‑
30bp，更优选为16
‑
25bp；和/或，所述至少部分序列起始于所述反向互补序列的3
’
端的第1～5个碱基中的任意一个，优选第1～3个碱基中的任意一个，更优选第1个或第2个碱基。
[0016]本申请第二方面提供了一种扩增TCRαβ单链的方法，所述方法包括：
[0017]以cDNA为模板分别进行TCRα链和β链的PCR扩增，获得在TCRβC区3
’
末端加上第一2A序列或第二2A序列的β链扩增产物，以及在TCRαV区5
’
端加上第三2A序列的α链扩增产物；
[0018]以α链扩增产物和β链扩增产物为模板，通过重叠PCR扩增获得α链和β链的单链序列；
[0019]其中，第一2A序列和第二2A序列各自独立地选自完整的2A序列或截短的2A序列，所述第三2A序列为第一2A序列或第二2A序列的反向互补序列的至少部分序列。
[0020]在其中一个实施例中，所述截短的2A序列的长度为10
‑
63bp；和/或，所述第三2A序列的长度为10
‑
64bp，优选为15
‑
30bp，更优选为16
‑
25bp；和/或，所述至少部分序列起始于所述反向互补序列的3
’
端的第1～5个碱基中的任意一个，优选第1～3个碱基中的任意一个，更优选第1个或第2个碱基；和/或，可选地，所述2A序列为编码2A肽的核苷酸序列，优选地，所述2A肽选自T2A、F2A、E2A或P2A，更优选地，所述2A肽为T2A。
[0021]在其中一个实施例中，所述方法还包括用裂解液裂解单T细胞，获得含有mRNA的裂解产物。
[0022]在其中一个实施例中，所述方法还包括以所述裂解产物为模板，直接进行逆转录获得双链cDNA。
[0023]可选地，所述逆转录使用的引物组包括逆转录正向引物和逆转录反向引物，其中，所述逆转录正向引物包括5
’‑
第一Read1序列
‑
TTTCTTATTrGrG+G
‑3’
或SEQ ID NO.95(5
’‑
CTACACGACGCTCTTCCGATCT
‑
NNNNNNNNNNNNNNNN
‑
NNNNNNNNNN
‑
TTTCTTATATrGrGrG
‑3’
)所示的核苷酸序列，所述逆转录反向引物包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
[0024]在其中一个实施例中，所述方法还包括以逆转录产物为模板，经cDNA扩增进行模板富集。
[0025]可选地，所述cDNA扩增使用的引物组包括cDNA扩增正向引物和cDNA扩增反向引物；其中，所述cDNA扩增正向引物包括第二Read1序列，所述cDNA扩增反向引物包括SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
[0026]其中，所述第二Read1序列与第一Read1序列相同或不同。
[0027]在其中一个实施例中，所述TCRα链的PCR扩增使用如下所示引物组：
[0028]用于TCRA扩增的正向引物组包括至少2条TRAV正向引物，每条TRAV正向引物各自独立地包括第三2A序列、ATG起始序列和TRAV基因上游特异性核苷酸序列。
[0029]所述TRAV基因上游特异性核苷酸序列选如下核苷酸序列中的一种或多种：SEQ ID NO.47中第25
‑
49位的核苷酸序列、SEQ ID NO.48中第25
‑
50位的核苷酸序列、SEQ ID NO.49中第25
‑
43位的核苷酸序列、SEQ ID NO.50中第25
‑
42位的核苷酸序列、SEQ ID N本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.如下序列在TCRαβ单链扩增中的应用，所述序列包括：1)第一2A序列和/或第二2A序列；以及2)第三2A序列；其中，第一2A序列和第二2A序列各自独立地选自完整的2A序列或截短的2A序列，所述第三2A序列为第一2A序列或第二2A序列的反向互补序列的至少部分序列。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述2A序列为编码2A肽的核苷酸序列；优选地，所述2A肽选自T2A、F2A、E2A或P2A；更优选地，所述2A肽为T2A。3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述截短的2A序列的长度为10
‑
63bp；和/或所述第三2A序列的长度为10
‑
64bp，优选为15
‑
30bp，更优选为16
‑
25bp；和/或所述至少部分序列起始于所述反向互补序列的3
’
端的第1～5个碱基中的任意一个，优选第1～3个碱基中的任意一个，更优选第1个或第2个碱基。4.一种扩增TCRαβ单链的方法，其特征在于，所述方法包括：以cDNA为模板分别进行TCRα链和β链的PCR扩增，获得在TCRβC区3
’
末端加上第一2A序列或第二2A序列的β链扩增产物，以及在TCRαV区5
’
端加上第三2A序列的α链扩增产物；以α链扩增产物和β链扩增产物为模板，通过重叠PCR扩增获得α链和β链的单链序列；其中，第一2A序列和第二2A序列各自独立地选自完整的2A序列或截短的2A序列，所述第三2A序列为第一2A序列或第二2A序列的反向互补序列的至少部分序列。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述截短的2A序列的长度为10
‑
63bp；和/或所述第三2A序列的长度为10
‑
64bp，优选为15
‑
30bp，更优选为16
‑
25bp；和/或所述至少部分序列起始于所述反向互补序列的3
’
端的第1～5个碱基中的任意一个，优选第1～3个碱基中的任意一个，更优选第1个或第2个碱基；和/或所述2A序列为编码2A肽的核苷酸序列，优选地，所述2A肽选自T2A、F2A、E2A或P2A，更优选地，所述2A肽为T2A。6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述方法还包括用裂解液裂解单T细胞，获得含有mRNA的裂解产物。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以所述裂解产物为模板，直接进行逆转录获得双链cDNA；可选地，所述逆转录使用的引物组包括逆转录正向引物和逆转录反向引物，其中，所述逆转录正向引物包括5
’‑
第一Read1序列
‑
TTTCTTATTrGrG+G
‑3’
或SEQ ID NO.95所示的核苷酸序列，所述逆转录反向引物包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以逆转录产物为模板，经cDNA扩增进行模板富集；可选地，所述cDNA扩增使用的引物组包括cDNA扩增正向引物和cDNA扩增反向引物；其中，所述cDNA扩增正向引物包括第二Read1序列，所述cDNA扩增反向引物包括SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；其中，所述第二Read1序列与第一Read1序列相同或不同。
9.根据权利要求4
‑
8任一项所述的方法，其特征在于，所述TCRα链的PCR扩增使用如下所示引物组：用于TCRA扩增的正向引物组包括至少2条TRAV正向引物，每条TRAV正向引物各自独立地包括第三2A序列、ATG起始序列和TRAV基因上游特异性核苷酸序列；所述TRAV基因上游特异性核苷酸序列选自如下核苷酸序列中的一种或多种：SEQ IDNO.47中第25
‑
49位的核苷酸序列、SEQ ID NO.48中第25
‑
50位的核苷酸序列、SEQ IDNO.49中第25
‑
43位的核苷酸序列、SEQ ID NO.50中第25
‑
42位的核苷酸序列、SEQ IDNO.51中第25
‑
45位的核苷酸序列、SEQ ID NO.52中第25
‑
48位的核苷酸序列、SEQ IDNO.53中第25
‑
46位的核苷酸序列、SEQ ID NO.54中第25
‑
45位的核苷酸序列、SEQ IDNO.55中第25
‑
46位的核苷酸序列、SEQ ID NO.56中第25
‑
41位的核苷酸序列、SEQ IDNO.57中第25
‑
45位的核苷酸序列、SEQ ID NO.58中第25
‑
48位的核苷酸序列、SEQ IDNO.59中第25
‑
45位的核苷酸序列、SEQ ID NO.60中第25
‑
57位的核苷酸序列、SEQ IDNO.61中第25
‑
48位的核苷酸序列、SEQ ID NO.62中第25
‑
52位的核苷酸序列、SEQ IDNO.63中第25
‑
55位的核苷酸序列、SEQ ID NO.64中第25
‑
51位的核苷酸序列、SEQ IDNO.65中第25
‑
52位的核苷酸序列、SEQ ID NO.66中第25
‑
45位的核苷酸序列、SEQ IDNO.67中第25
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48位的核苷酸序列、SEQ ID NO.68中第25
‑
45位的核苷酸序列、SEQ IDNO.69中第25
‑
48位的核苷酸序列、SEQ ID NO.70中第25
‑
44位的核苷酸序列、SEQ IDNO.71中第25
‑
44位的核苷酸序列、SEQ ID NO.72中第25
‑
48位的核苷酸序列、SEQ IDNO.73中第25
‑
42位的核苷酸序列、SEQ ID NO.74中第25
‑
47位的核苷酸序列、SEQ IDNO.75中第25
‑
52位的核苷酸序列、SEQ ID NO.76中第25
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45位的核苷酸序列、SEQ IDNO.77中第25
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52位的核苷酸序列、SEQ ID NO.78中第25
‑
46位的核苷酸序列、SEQ IDNO.79中第25
‑
52位的核苷酸序列、SEQ ID NO.80中第25
‑
45位的核苷酸序列、SEQ IDNO.81中第25
‑
40位的核苷酸序列、SEQ ID NO.82中第25
‑
49位的核苷酸序列、SEQ IDNO.83中第25
‑
50位的核苷酸序列、SEQ ID NO.84中第25
‑...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢兴旺，蒋栋，翟佳慧，薛江芝，李雅真，
申请(专利权)人：北京可瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：