重组慢病毒载体和293T-CD3细胞系及其构建方法与应用技术

本发明专利技术提供一种重组慢病毒载体和293T

【技术实现步骤摘要】
重组慢病毒载体和293T
‑
CD3细胞系及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体地说，涉及一种重组慢病毒载体和293T
‑
CD3细胞系及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]293T细胞是由293细胞通过基因技术派生出的细胞系，是经过腺病毒E1A基因的转染，能表达SV40大T抗原，含有SV40复制起始点与启动子区。许多真核表达载体如pcDNA3.1中含有SV40病毒的复制起始位点，可以在表达SV40病毒T抗原的细胞系中复制，从而提高外源基因的表达水平。同时，293T细胞容易被VSV
‑
G包膜的慢病毒转导，因此293T细胞广泛应用于慢病毒的包装。
[0003]慢病毒是细胞工程领域的主要传递载体，但目前还没有统一的慢病毒滴定的标准。目前最常规的慢病毒滴度的方法是使用qPCR来估计前病毒拷贝的数量，该前病毒已经整合到了滴定细胞的基因组中。
[0004]当293T细胞用于检测表达TCR的慢病毒的病毒滴度时，如果按照传统的qPCR法通过估计前病毒拷贝的数量来测定病毒滴度的话，由于存在TCR基因可能无法表达的情况或者是TCR能够表达但无法呈递到细胞表面的情况，会导致检测到病毒滴度与实际的病毒存在较大差异，从而限制了293T细胞在该领域中的应用。
[0005]因此，有必要对滴定表达TCR的慢病毒的方法进行进一步研究。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种新型的重组慢病毒载体和293T
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CD3细胞系及其构建方法与应用。
[0007]为了实现本专利技术目的，本专利技术提供一种基因改造的293T
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CD3细胞株，该细胞株可稳定表达CD3。该基因改造的293T
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CD3细胞株用于测定表达TCR的慢病毒的病毒滴度时，TCR和CD3同时表达于细胞表面，为流式检测TCR的表达进而快速简便地判断TCR
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慢病毒的滴度奠定了基础。
[0008]第一方面，本专利技术提供一种重组慢病毒载体，所述重组慢病毒载体包含CD3D的编码核酸分子、CD3G的编码核酸分子、CD3E的编码核酸分子和CD247的编码核酸分子；其中，各编码核酸分子间以2A肽编码核酸分子相连；且CD3D的编码核酸分子、CD3G的编码核酸分子、CD3E的编码核酸分子和CD247的编码核酸分子位于同一表达盒内。
[0009]本专利技术中，CD3D的编码核酸分子、CD3G的编码核酸分子、CD3E的编码核酸分子和CD247的编码核酸分子在所述表达盒中的连接顺序没有特别的限制，只要表达后能够组装成完整的CD3分子即可。根据本专利技术一种优选的实施方式，在所述表达盒中，CD3D的编码核酸分子、CD3G的编码核酸分子、CD3E的编码核酸分子和CD247的编码核酸分子从5
’
端到3
’
端按顺序依次连接。
[0010]本专利技术中，CD3D、CD3G、CD3E和CD247的核苷酸序列可以为CD3D、CD3G、CD3E和CD247
的公知序列，优选分别如SEQ ID No.1
‑
4所示。
[0011]本专利技术中，所述2A肽编码核酸分子可以选自F2A的编码核酸分子、T2A的编码核酸分子、E2A的编码核酸分子和P2A的编码核酸分子等中的至少一种。其中，所述F2A的编码核酸分子的核苷酸序列可以为本领域所公知的，优选如SEQ ID NO.6所示。所述T2A的编码核酸分子的核苷酸序列可以为本领域所公知的，优选如SEQ ID NO.7所示。所述E2A的编码核酸分子的核苷酸序列可以为本领域所公知的，优选如SEQ ID NO.8所示。所述P2A的编码核酸分子的核苷酸序列可以为本领域所公知的，优选如SEQ ID NO.9所示。
[0012]本专利技术中，尽管只要将各编码核酸分子以2A肽编码核酸分子相间隔即可实现本专利技术的目的，但本专利技术的专利技术人在研究中发现，当各编码核酸分子间以如下方式相连时能够进一步提高以本专利技术方法测定的滴度的准确性。因此，根据本专利技术一种优选的实施方式，所述表达盒包含编码CD3D
‑
F2A
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CD3G
‑
T2A
‑
CD3E
‑
E2A
‑
CD247的核酸分子，更优选地，所述表达盒包含如SEQ ID NO.5所示的核酸分子。
[0013]进一步地，所述表达盒还包含抗性基因。
[0014]优选地，所述抗性基因位于所述表达盒的3
’
端。
[0015]优选地，所述抗性基因为真核抗性基因。更优选地，所述真核抗性基因为潮霉素抗性基因(HygR)、杀稻瘟菌素S抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、遗传霉素抗性基因或腐草霉素D1抗性基因等。
[0016]本专利技术中，所述表达盒优选由真核启动子驱动；所述真核启动子优选为EF
‑
1α、CMV、SV40或PGK1等。
[0017]本专利技术中，所述表达盒的终止子优选为TGA、TAG或TAA。
[0018]优选地，所述表达盒包含真核抗性基因，在这种情况下，CD3D、CD3G、CD3E、CD247和真核抗性基因的顺序可以互换，各2A肽编码核酸分子也可以互换。但本专利技术的专利技术人在研究中发现，如果真核抗性基因位于CD3相关元件之间，会降低CD3各分子表达时的剪切效率(降低率在2
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5％之间)，从而影响CD3分子的完整表达率，因此，优选地，CD3D、CD3G、CD3E、CD247的插入位点介于启动子(如EF
‑
1α)之后和真核抗性基因(例如HygR)之前，以保证CD3分子在真核细胞中的完整表达。根据本专利技术一种优选的实施方式，所述抗性基因为潮霉素抗性基因(HygR)，所述表达盒包含编码CD3D
‑
F2A
‑
CD3G
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T2A
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CD3E
‑
E2A
‑
CD247
‑
P2A
‑
HygR的核酸分子。
[0019]本专利技术的重组慢病毒载体中，酶切位点不是必需的，即，可以不含有酶切位点。
[0020]第二方面，本专利技术提供一种293T
‑
CD3细胞系，其含有上述的重组慢病毒载体，且所述293T
‑
CD3细胞系能够表达CD3蛋白。
[0021]本专利技术还提供一种293T
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CD3细胞系(生物材料名称293T
‑
CD3
‑
3#)，其保藏编号为CGMCC NO.45185。该细胞系在表达TCR的慢病毒的滴度测定方面具有显著优势，其具有更高的准确率。
[0022]第三方面，本专利技术提供293T
‑
CD3细胞系的构建方法，其包括：将上述的重组慢病毒载体和慢病毒包装载体转染293T细胞，获得包装的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.重组慢病毒载体，其特征在于，所述重组慢病毒载体包含CD3D的编码核酸分子、CD3G的编码核酸分子、CD3E的编码核酸分子和CD247的编码核酸分子；其中，各编码核酸分子间以2A肽编码核酸分子相连；且CD3D的编码核酸分子、CD3G的编码核酸分子、CD3E的编码核酸分子和CD247的编码核酸分子位于同一表达盒内。2.根据权利要求1所述的重组慢病毒载体，其特征在于，所述表达盒还包含抗性基因；优选地，所述抗性基因位于所述表达盒的3
’
端；和/或所述抗性基因为真核抗性基因；更优选地，所述真核抗性基因为潮霉素抗性基因、杀稻瘟菌素S抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、遗传霉素抗性基因或腐草霉素D1抗性基因。3.根据权利要求1或2所述的重组慢病毒载体，其特征在于，所述2A肽编码核酸分子选自F2A的编码核酸分子、T2A的编码核酸分子、E2A的编码核酸分子和P2A的编码核酸分子中的至少一种；和/或CD3D的编码核酸分子、CD3G的编码核酸分子、CD3E的编码核酸分子和CD247的编码核酸分子从5
’
端到3
’
端按顺序依次连接；和/或CD3D、CD3G、CD3E和CD247的核苷酸序列分别如SEQ ID No.1
‑
4所示；优选地，所述表达盒包含编码CD3D
‑
F2A
‑
CD3G
‑
T2A
‑
CD3E
‑
E2A
‑
CD247的核酸分子；更优选地，所述表达盒包含如SEQ ID NO.5所示的核酸分子；和/或所述表达盒包含编码CD3D
‑
F2A
‑
CD3G
‑
T2A
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CD3E
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E2A
‑
CD247
‑
P2A
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋栋，谢兴旺，史云强，王雪艳，王江华，王淼，
申请(专利权)人：北京可瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：