扩增TCRα链和/或β链的引物组合及其应用制造技术

本发申请涉及扩增TCRα链和/或β链的引物组合及其应用。本发明专利技术提供了通用的扩增TCRα链和/或β链的引物组合，细胞可直接裂解进行逆转录，逆转录产物经cDNA扩增进行模板富集，之后进行TCR序列扩增。该方法优化了TCR扩增的实验条件、简化了实验过程，可有效提高扩增效率。增效率。

【技术实现步骤摘要】
NO.7所示的核苷酸序列。其中，所述第三Read1序列与第二Read1序列相同或不同；和/或，第四Read1序列与第三Read1序列相同或不同。
[0012]可选地，所述第一轮巢式PCR引物组的正向引物还包括载体片段序列。
[0013]在其中一个实施例中，所述巢式PCR引物组还包括第二轮巢式PCR引物组，所述第二轮巢式PCR引物组的正向引物包括第五Read1序列或载体片段序列或第二测序接头1；所述第二轮巢式PCR引物组的反向引物包括第二轮α链的反向引物和/或第二轮β链的反向引物，可选地，所述第二轮α链的反向引物包括SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列或包括5
’‑
Read2序列1
‑
Barcode
‑
AGTCTCTCAGCTGGTACACG
‑3’
，所述第二轮β链的反向引物包括SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列或包括5
’‑
Read2序列2
‑
Barcode
‑
TCTGATGGCTCAAACACAGC
‑3’
。其中，所述第五Read1序列与第三Read1序列或第四Read1序列相同或不同，和/或，所述第一测序接头1与第二测序接头1相同或不同。
[0014]在其中一个实施例中，所述巢式PCR引物组还包括第三轮巢式PCR引物组，所述第三轮巢式PCR引物组的正向引物包括第三测序接头1，所述第三轮巢式PCR引物组的反向引物包括测序接头2和Read2序列3。其中，所述第三测序接头1与第二测序接头1相同或不同。
[0015]可选地，所述第一测序接头1、第二测序接头1和第三测序接头1各自独立地选自illumina测序的P5接头的至少部分序列，和/或，所述测序接头2选自illumina测序的P7接头的至少部分序列。
[0016]可选地，所述Read2序列1和Read2序列2相同或不同；和/或，Read2序列1、Read2序列2、Read2序列3各自独立的选自illumina测序的Read2的至少部分序列；和/或，Read2序列1和Read2序列3二者序列至少部分重叠；和/或，Read2序列2和Read2序列3二者序列至少部分重叠。
[0017]一种引物组合，所述引物组合包括巢式PCR引物组，所述巢式PCR引物组包括第一轮巢式PCR引物组，所述第一轮巢式PCR引物组的正向引物包括第三Read1序列或包括5
’‑
第一测序接头1
‑
第四Read1序列
‑3’
；所述第一轮巢式PCR引物组的反向引物包括第一轮α链的反向引物和/或第一轮β链的反向引物，所述第一轮α链的反向引物包括SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列；所述第一轮β链的反向引物包括SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列。其中，所述第四Read1序列与第三Read1序列相同或不同。
[0018]可选地，所述第一轮巢式PCR引物组的正向引物还包括载体片段序列。
[0019]在其中一个实施例中，所述巢式PCR引物组还包括第二轮巢式PCR引物组，所述第二轮巢式PCR引物组的正向引物包括第五Read1序列或载体片段序列或第二测序接头1，其中，所述第五Read1序列与第三Read1序列或第四Read1序列相同或不同，和/或，所述第一测序接头1与第二测序接头1相同或不同；所述第二轮巢式PCR引物组的反向引物包括第二轮α链的反向引物和/或第二轮β链的反向引物，所述第二轮α链的反向引物包括SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列或包括5
’‑
Read2序列1
‑
Barcode
‑
AGTCTCTCAGCTGGTACACG
‑3’
，所述第二轮β链的反向引物包括SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列或包括5
’‑
Read2序列2
‑
Barcode
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TCTGATGGCTCAAACACAGC
‑3’
。
[0020]在其中一个实施例中，所述第一轮巢式PCR引物组的正向引物和/或所述第二轮巢式PCR引物组的正向引物还包括载体片段序列。
[0021]在其中一个实施例中，所述巢式PCR引物组还包括第三轮巢式PCR引物组，所述第
三轮巢式PCR引物组的正向引物包括第三测序接头1，所述第三轮巢式PCR引物组的反向引物包括测序接头2和Read2序列3。其中，所述第三测序接头1与第二测序接头1相同或不同。
[0022]可选地，所述第一测序接头1、第二测序接头1和第三测序接头1各自独立地选自illumina测序的P5接头的至少部分序列，和/或所述测序接头2选自illumina测序的P7接头的至少部分序列。
[0023]可选地，所述Read2序列1和Read2序列2相同或不同；和/或，Read2序列1、Read2序列2、Read2序列3各自独立的选自选自illumina测序的Read2的至少部分序列；和/或，Read2序列1和Read2序列3二者序列至少部分重叠；和/或，Read2序列2和Read2序列3二者序列至少部分重叠。
[0024]可选地，所述引物组合还包括逆转录引物组，所述逆转录引物组的正向引物包括5
’‑
第一Read1序列
‑
TTTCTTATTrGrG+G
‑3’
或SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列，所述逆转录引物组的反向引物包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。
[0025]可选地，所述引物组合还包括cDNA扩增引物组，所述cDNA扩增引物组的正向引物包括第二Read1序列，所述cDNA扩增引物组的反向引物包括SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。
[0026]一种试剂盒，所述试剂盒包括上述任一项所述的引物组合。
[0027]在其中一个实施例中，所述试剂盒还包括细胞裂解液。
[0028]可选地，所述细胞裂解包括Triton X
‑
100和RNase inhibitor。
[0029]一种扩增TCR α链和/或β链的方法，所述方法包括如下步骤：
[0030](1)裂解液裂解单T细胞，获得含有RNA的裂解产物；
[0031](2)以裂解产物为模板，直接进行逆转录获得双链cDNA；
[0032](3)以逆转录产物为模板经cDNA扩增进行模板富集；及
[0033](4)以cDNA扩增产物为模板分别进行TCR α链和/或β链的至少两轮巢式PCR扩增。
[0034]在其中一个实施例中，所述逆转录使用上述逆转录引物组。
[0035]在其中一个实施例中，所述cDNA扩增使用所述的cDNA扩增引物组。
[0036]在其中一个实施例中，所述两轮巢式PCR扩增使用上述两轮巢式PCR引物组。
[0037]在其中一个实施例中，所述三轮巢式PCR扩增使用上述的三轮巢式本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种引物组合，其特征在于，所述引物组合包括逆转录引物组，所述逆转录引物组包括逆转录正向引物和逆转录反向引物；其中，所述逆转录正向引物包括5
’‑
第一Read1序列
‑
TTTCTTATTrGrG+G
‑3’
，所述逆转录反向引物包括SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述引物组合还包括cDNA扩增引物组，所述cDNA扩增引物组包括cDNA扩增正向引物和cDNA扩增反向引物；其中，所述cDNA扩增正向引物包括第二Read1序列，所述cDNA扩增反向引物包括SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列；其中，所述第二Read1序列与第一Read1序列相同或不同。3.根据权利要求1或2所述的引物组合，其特征在于，所述引物组合还包括巢式PCR引物组，所述巢式PCR引物组包括第一轮巢式PCR引物组；所述第一轮巢式PCR引物组的正向引物包括第三Read1序列或包括5
’‑
第一测序接头1
‑
第四Read1序列
‑3’
；所述第一轮巢式PCR引物组的反向引物包括第一轮α链的反向引物和/或第一轮β链的反向引物，所述第一轮α链的反向引物包括SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列，所述第一轮β链的反向引物包括SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列；其中，所述第三Read1序列与第二Read1序列相同或不同；和/或，第四Read1序列与第三Read1序列相同或不同；可选地，所述第一轮巢式PCR引物组的正向引物还包括载体片段序列；和/或所述巢式PCR引物组还包括第二轮巢式PCR引物组，所述第二轮巢式PCR引物组的正向引物包括第五Read1序列或载体片段序列或第二测序接头1；所述第二轮巢式PCR引物组的反向引物包括第二轮α链的反向引物和/或第二轮β链的反向引物，所述第二轮α链的反向引物包括SEQ ID NO.9所示的核苷酸序列或包括5
’‑
Read2序列1
‑
Barcode
‑
AGTCTCTCAGCTGGTACACG
‑3’
，所述第二轮β链的反向引物包括SEQ ID NO.10所示的核苷酸序列或包括5
’‑
Read2序列2
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Barcode
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TCTGATGGCTCAAACACAGC
‑3’
；其中，所述第五Read1序列与第三Read1序列或第四Read1序列相同或不同，和/或，所述第一测序接头1与第二测序接头1相同或不同。4.根据权利要求3所述的引物组合，其特征在于，所述巢式PCR引物组还包括第三轮巢式PCR引物组，所述第三轮巢式PCR引物组的正向引物包括第三测序接头1，所述第三轮巢式PCR引物组的反向引物包括测序接头2和Read2序列3；其中，所述第三测序接头1与第二测序接头1相同或不同；可选地，所述第一测序接头1、第二测序接头1和第三测序接头1各自独立地选自illumina测序的P5接头的至少部分序列，和/或，所述测序接头2选自illumina测序的P7接头的至少部分序列；可选地，所述Read2序列1和Read2序列2相同或不同；和/或，Read2序列1、Read2序列2、Read2序列3各自独立的选自illumina测序的Read2的至少部分序列；和/或，Read2序列1和Read2序列3二者序列至少部分重叠；和/或，Read2序列2和Read2序列3二者序列至少部分重叠。5.一种引物组合，其特征在于，所述引物组合包括巢式PCR引物组，所述巢式PCR引物组包括第一轮巢式PCR引物组，所述第一轮巢式PCR引物组的正向引物包括第三Read1序列或包括5
’‑
第一测序接头1
‑
第四Read1序列
‑3’
；所述第一轮巢式PCR引物组的反向引物包括第
一轮α链的反向引物和/或第一轮β链的反向引物，所述第一轮α链的反向引物包括SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列，所述第一轮β链的反向引物包括SEQ ID NO.7所示的核苷酸序列；其中，所述第四Read1序列与第三Read1...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢兴旺，蒋栋，翟佳慧，薛江芝，李雅真，
申请(专利权)人：北京可瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：