用于治疗具有KRAS突变的癌症的组合物及其用途制造技术

本申请提供了用于特异性靶向突变的KRAS的指导RNA和基因组编辑复合物或纳米颗粒。示例性基因组编辑复合物或纳米颗粒包括细胞穿透肽，以及任选地DNA核酸酶(如Cas9)或编码所述DNA核酸酶的多核苷酸。述DNA核酸酶的多核苷酸。述DNA核酸酶的多核苷酸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗具有KRAS突变的癌症的组合物及其用途
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年4月24日提交的法国申请号FR2004126的优先权，其内容通过引用以其整体并入本文，用于所有目的。


[0003]本申请涉及用于特异性靶向突变的KRAS的指导RNA和基因组编辑复合物或纳米颗粒。
[0004]以ASCII文本文件提交序列表
[0005]下列以ASCII文本文件提交的内容其整体通过引用被并入本文：计算机可读形式(CRF)的序列表(文件名称：7373720001241SEQLIST.TXT，记录日期：2021年4月23日，大小：87KB)。

技术介绍

[0006]RAS亚家族成员KRAS是癌症包括高致死性肺癌、结肠癌和胰腺癌中最常发生突变的致癌基因(Cox et al.2014Nat Rev Drug Discov 13,828)。在KRAS中激活突变在癌症起始、传播和维持中发挥强力作用，代表着重要的治疗靶标(Cox et al.2014)。一种常见的癌症相关突变发生在KRAS的甘氨酸编码密码子12处。具体地，单核苷酸错义取代c.35G>T和c.35G>A分别以缬氨酸(G12V)和天冬氨酸(G12D)取代第12位的甘氨酸。G12V和G12D取代是胰腺腺癌(分别为30％和51％)和结直肠腺癌(分别为27％和45％)中最常见的突变，并且与不良预后相关(Jones,S.et al.2008,Science 321,1801；Wood,L.D.et al.2007,Science 318,1108)。
[0007]现今，迫切需要一种靶向KRAS突变的强力策略。尽管已经对靶向RAS依赖性癌症进行了数次尝试，但对RAS蛋白的直接抑制尚未成功，并且大多数方法影响突变RAS的下游效应器。KRAS(G12C)特异性抑制剂(Patricelli et al.2016Cancer Discov 6:316)和非突变体选择性RAS结合结构域抑制剂(Athuluri
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Divakar et al.2016.Cell 165:643)显示出直接靶向突变的RAS致癌基因的潜力。直接靶向突变的RAS致癌基因有破坏异常RAS蛋白及其下游效应器途径这两者的功能的可能。然而，由于其结构复杂，生产这种化学品具有挑战性，并且针对比KRAS(G12C)发生得更频繁的KRAS(G12D)或KRAS(G12V)使用小分子并未实现突变特异性抑制。使用选择性抑制突变体KRAS mRNA的小干扰RNA(siRNA)进行KRAS沉默也有报道，但考虑到KRAS突变体的持续表达，对靶RNA的抑制需要永久递送(Zorde Khvalevsky et al.2013Proc Natl Acad Sci 110:20723)以维持彻底的击倒(Brummelkamp et al.2002Cancer Cell 2:243)。
[0008]本文引用的所有出版物、专利、专利申请和公开的专利申请的公开内容均通过引用以其整体并入本文。

技术实现思路

[0009]本申请在一个方面提供了非天然存在的多核苷酸，其包括用于靶向突变的KRAS的指导RNA，所述用于靶向突变的KRAS的指导RNA包括决定特异性的CRISPR RNA(crRNA)，所述决定特异性的CRISPR RNA包括与选自SEQ ID NO:1
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37、241
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257和271的靶序列基本上互补的核苷酸序列。在一些实施方式中，所述指导RNA还包括辅助反式激活crRNA(tracrRNA)。在一些实施方式中，与靶序列基本上互补的所述核苷酸序列选自SEQ ID NO:1、3、6、8、15、16、19
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21、23、29、31、33和34。在一些实施方式中，所述核苷酸序列与选自SEQ ID NO:1、3、6、8、15、16、19
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21、23、29、31、33和34的靶序列100％互补。在一些实施方式中，所述核苷酸序列与选自SEQ ID NO:3、19和34的靶序列100％互补。
[0010]在根据上述任一种非天然存在的多核苷酸的一些实施方式中，所述多核苷酸是化学修饰的。
[0011]在根据上述任一种非天然存在的多核苷酸的一些实施方式中，所述指导RNA的长度不超过约200个核苷酸。
[0012]本申请在另一方面提供了基因组编辑复合物，其包括a)第一细胞穿透肽，和b)靶向突变的KRAS的指导RNA，其中所述指导RNA包括上述任一种多核苷酸。在一些实施方式中，所述基因组编辑复合物还包括DNA核酸酶或编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列。在一些实施方式中，所述DNA核酸酶选自CRISPR相关蛋白(Cas)多肽、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶、其变体、其片段以及其组合。在一些实施方式中，所述DNA核酸酶包括Cas多肽。在一些实施方式中，所述Cas多肽是Cas9或Cas12a。
[0013]在根据上述任一种基因组编辑复合物的一些实施方式中，所述第一细胞穿透肽选自CADY、PEP
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1肽、PEP
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2肽、PEP
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3肽、VEPEP
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3肽、VEPEP
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6肽、VEPEP
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9肽和ADGN
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100肽。
[0014]在根据上述任一种基因组编辑复合物的一些实施方式中，所述第一细胞穿透肽还包括共价连接至所述第一细胞穿透肽的N端的一个或多个部分，并且其中所述一个或多个部分选自乙酰基、脂肪酸、胆固醇、聚乙二醇、核定位信号、核输出信号、抗体、多糖、连接体部分和靶向部分。在一些实施方式中，所述第一细胞穿透肽包括共价连接至所述第一细胞穿透肽的N端的乙酰基。在一些实施方式中，所述第一细胞穿透肽包括靶向部分，所述靶向部分包括共价连接至所述第一细胞穿透肽的N端的靶向肽。在一些实施方式中，所述靶向肽选自SEQ ID NO:196
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205和235
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240。
[0015]在根据上述任一种基因组编辑复合物的一些实施方式中，所述第一细胞穿透肽包括选自聚甘氨酸连接体部分、PEG部分、Aun、Ava和Ahx的连接体部分。在一些实施方式中，所述PEG部分由二至七个乙二醇单元组成。
[0016]在根据上述任一种基因组编辑复合物的一些实施方式中，所述第一细胞穿透肽从N端起包括乙酰基、靶向部分和共价连接至所述第一细胞穿透肽的N端的连接体部分。
[0017]在根据上述任一种基因组编辑复合物的一些实施方式中，所述第一细胞穿透肽还包括共价连接至所述第一细胞穿透肽的C端的一个或多个部分，并且其中所述一个或多个部分选自半胱酰胺、半胱氨酸、硫醇、酰胺、任选地被取代的次氮基三乙酸、羧基、任选地被取代的线性或分支C1‑
C6烷基、伯胺或仲胺、糖苷(osidic)衍生物本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.非天然存在的多核苷酸，其包括用于靶向突变的KRAS的指导RNA，所述用于靶向突变的KRAS的指导RNA包括决定特异性的CRISPR RNA(crRNA)，所述决定特异性的CRISPR RNA包括与选自SEQ ID NO:1
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37、241
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257和271的靶序列基本上互补的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的非天然存在的多核苷酸，其中所述指导RNA还包括辅助反式激活crRNA(tracrRNA)。3.根据权利要求1或权利要求2所述的非天然存在的多核苷酸，其中与靶序列基本上互补的所述核苷酸序列选自SEQ ID NO:1、3、6、8、15、16、19
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21、23、29、31、33和34。4.根据权利要求3所述的非天然存在的多核苷酸，其中所述核苷酸序列与选自SEQ ID NO:3、19和34的靶序列100％互补。5.根据权利要求1
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4中任一项所述的非天然存在的多核苷酸，其中所述多核苷酸是化学修饰的。6.根据权利要求1
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5中任一项所述的非天然存在的多核苷酸，其中所述指导RNA的长度不超过约200个核苷酸。7.基因组编辑复合物，其包括a)第一细胞穿透肽，和b)靶向突变的KRAS的指导RNA，其中所述指导RNA包括权利要求1
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6中任一项所述的多核苷酸。8.根据权利要求7所述的基因组编辑复合物，还包括DNA核酸酶或编码所述DNA核酸酶的核苷酸序列。9.根据权利要求8所述的基因组编辑复合物，其中所述DNA核酸酶选自CRISPR相关蛋白(Cas)多肽、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶、其变体、其片段以及其组合。10.根据权利要求9所述的基因组编辑复合物，其中所述DNA核酸酶包括Cas多肽。11.根据权利要求9或权利要求10所述的基因组编辑复合物，其中所述Cas多肽是Cas9。12.根据权利要求7
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11中任一项所述的基因组编辑复合物，其中所述第一细胞穿透肽选自CADY、PEP
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1肽、PEP
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2肽、PEP
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3肽、VEPEP
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3肽、VEPEP
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6肽、VEPEP
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9肽和ADGN
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100肽。13.根据权利要求7
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12中任一项所述的基因组编辑复合物，其中所述第一细胞穿透肽还包括共价连接至所述第一细胞穿透肽的N端的一个或多个部分，并且其中所述一个或多个部分选自乙酰基、脂肪酸、胆固醇、聚乙二醇、核定位信号、核输出信号、抗体、多糖、连接体部分和靶向部分。14.根据权利要求13所述的基因组编辑复合物，其中所述第一细胞穿透肽包括共价连接至所述第一细胞穿透肽的N端的乙酰基。15.根据权利要求13或权利要求14所述的基因组编辑复合物，其中所述第一细胞穿透肽包括靶向部分，所述靶向部分包括共价连接至所述第一细胞穿透肽的N端的靶向肽。16.根据权利要求15所述的基因组编辑复合物，其中所述靶向肽选自SEQ ID NO:196
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205和235
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240。17.根据权利要求7
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16中任一项所述的基因组编辑复合物，其中所述第一细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：N，
申请(专利权)人：阿迪根有限公司，
类型：发明
国别省市：