用于细胞内递送mRNA的肽和纳米颗粒制造技术

本申请涉及含肽复合物/纳米颗粒，其可用于将一种或多种mRNA(诸如，治疗性mRNA，如，编码肿瘤阻抑蛋白的mRNA)递送至细胞内。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于细胞内递送mRNA的肽和纳米颗粒相关申请本申请要求2017年10月16日提交的法国申请号1759645以及2018年4月17日提交的法国申请号1853370的优先权权益，其全部出于所有目的通过引用以其整体并入本文。提交ASCII文本文件上的序列表通过引用将在ASCII文本文件上的下列提交的内容以其整体并入本文：序列表的计算机可读形式(CRF)(文件名：737372001042SEQLIST.txt，记录的日期：2018年10月15日，大小：37KB)。
本专利技术涉及可用于将mRNA递送至细胞内的含肽复合物/纳米颗粒。
技术介绍
在此引用的所有出版物、专利、专利申请和公开的专利申请的公开内容均通过引用以其全文并入本文。为了使外源性mRNA或RNAi在治疗上适用，必须将mRNA或RNAi有效地递送至靶细胞例如靶标疾病的疾病细胞的内部。通常，RNA递送可以由病毒和非病毒载体介导。非病毒载体可以大规模生产并且易于工程改造。但是，它们受到低递送效率和在一些情况下细胞毒性的困扰。另一方面，病毒载体利用发展亲本mRNA以有效识别和感染细胞的高度进化机制。但是，它们的递送特性对于工程化和改进可具有挑战性。因此，需要用于在靶细胞内部有效递送mRNA或RNAi的改进方法。
技术实现思路
本申请提供包含细胞穿透肽的复合物和纳米颗粒，其可用于将一种或多种mRNA(诸如，编码治疗性蛋白(如，肿瘤阻抑蛋白)的mRNA)递送至细胞内。mRNA的细胞内递送允许表达由mRNA编码的产物。在一些实施方式中，mRNA编码蛋白质，诸如治疗性蛋白、缺陷性蛋白质或非功能性蛋白质的功能性变体。在一些实施方式中，mRNA编码嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方式中，复合物和纳米颗粒包括抑制性RNA(RNAi)，诸如靶向内源性基因的RNAi。在一些实施方式中，RNAi靶向疾病相关的内源性基因，如癌基因。在一些任意方式中，RNAi靶向外源性基因。在一些实施方式中，提供了用于细胞内递送mRNA的mRNA递送复合物，其包含细胞穿透肽(CPP)和mRNA，其中细胞穿透肽选自VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽和ADGN-100肽。在一些实施方式中，提供了用于细胞内递送mRNA的mRNA递送复合物，其包含细胞穿透肽(CPP)和mRNA，其通过包含以下步骤的方法制备：a)使包含mRNA的第一溶液与包含CPP的第二溶液混合，从而形成第三溶液，其中第三溶液包含或被调整以包含i)约0-5％的蔗糖、ii)约0-5％的葡萄糖、iii)约0-50％的DMEM、iv)约0-80mM的NaCl、或v)约0-20％的PBS；以及b)培育第三溶液以允许形成mRNA递送复合物。在一些实施方式中，第一溶液包含无菌水中的mRNA和/或第二溶液包含无菌水中的CPP。在一些实施方式中，在步骤b)的培育之后，第三溶液被调整以包含i)约0-5％的蔗糖、ii)约0-5％的葡萄糖、iii)约0-50％的DMEM、iv)约0-80mM的NaCl、或v)约0-20％的PBS。在一些实施方式中，提供了用于细胞内递送mRNA的mRNA递送复合物，其包含细胞穿透肽(CPP)和mRNA，其中mRNA编码治疗性蛋白。在一些实施方式中，治疗性蛋白替换缺乏或异常的蛋白质、扩增现有途径、提供新功能或活性或干扰分子或有机体。在一些实施方式中，提供了用于细胞内递送mRNA的mRNA递送复合物，其包含细胞穿透肽(CPP)和mRNA，其中mRNA递送复合物进一步包含RNAi。在一些实施方式中，RNAi是siRNA、shRNA或miRNA。在一些实施方式中，mRNA编码用于治疗疾病或病症的治疗性蛋白，和RNAi靶向RNA，其中RNA的表达与疾病或病症相关。在一些实施方式中，根据上述任意的mRNA递送复合物，细胞穿透肽是VEPEP-3肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽包含选自SEQIDNO:1-14的氨基酸序列。在一些实施方式中，细胞穿透肽包含SEQIDNO:75或76的氨基酸序列。在一些实施方式中，根据上述任意的mRNA递送复合物，细胞穿透肽是VEPEP-6肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽包含选自SEQIDNO:15-40的氨基酸序列。在一些实施方式中，细胞穿透肽包含SEQIDNO:77的氨基酸序列。在一些实施方式中，根据上述任意的mRNA递送复合物，细胞穿透肽是VEPEP-9肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽包含选自SEQIDNO:41-52的氨基酸序列。在一些实施方式中，细胞穿透肽包含SEQIDNO:78的氨基酸序列。在一些实施方式中，根据上述任意的mRNA递送复合物，细胞穿透肽是ADGN-100肽。在一些实施方式中，细胞穿透肽包含选自SEQIDNO:53-70的氨基酸序列。在一些实施方式中，细胞穿透肽包含SEQIDNO:79或80的氨基酸序列。在一些实施方式中，根据上述任意的mRNA递送复合物，细胞穿透肽与mRNA共价连接。在一些实施方式中，根据上述任意的mRNA递送复合物，细胞穿透肽还包含与细胞穿透肽的N末端共价连接的一个或多个部分，其中一个或多个部分选自乙酰基、脂肪酸、胆固醇、聚乙二醇、核定位信号、核输出信号、抗体或其片段、多糖和靶向分子。在一些实施方式中，细胞穿透肽包含与其N末端共价连接的乙酰基基团。在一些实施方式中，根据上述任意的mRNA递送复合物，细胞穿透肽还包含与细胞穿透肽的C末端共价连接的一个或多个部分，其中一个或多个部分选自半胱酰胺(cysteamide)、半胱氨酸、硫醇、酰胺、任选取代的次氮基三乙酸、羧基、任选取代的直链或分枝C1-C6烷基、伯或仲胺、糖苷(osidic)衍生物、脂质、磷脂、脂肪酸、胆固醇、聚乙二醇、核定位信号、核输出信号、抗体或其片段、多糖和靶向分子。在一些实施方式中，细胞穿透肽包含与其C末端共价连接的半胱酰胺基团。在一些实施方式中，根据上述任意的mRNA递送复合物，mNRA递送复合物中的至少一些细胞穿透肽通过键与靶向部分连接。在一些实施方式中，键是共价的。在一些实施方式中，根据上述任意的mRNA递送复合物，mRNA编码治疗性蛋白。在一些实施方式中，mRNA编码肿瘤阻抑蛋白。在一些实施方式中，根据上述任意的mRNA递送复合物，mRNA递送复合物还包含RNAi。在一些实施方式中，RNAi靶向癌基因，进行下调。在一些实施方式中，根据上述任意的mRNA递送复合物，细胞穿透肽与mRNA的摩尔比为约1：1和约100：1之间。在一些实施方式中，根据上述任意的mRNA递送复合物，mRNA递送复合物的平均直径为约20nm和约1000nm之间。在一些实施方式中，提供了包含核的纳米颗粒，该核包含根据上述任意的实施方式的mRNA递送复合物。在一些实施方式中，核还包含根据上述任意的实施方式的一种或多种另外的mRNA递送复合物。在一些实施方式中，核还包含RNAi。在一些实施方式中，RNAi靶向癌基因，进行下调。在一些实施方式中，RNAi在包含细胞穿透肽和本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于细胞内递送mRNA的包含细胞穿透肽(CPP)和所述mRNA的mRNA递送复合物，其中所述细胞穿透肽选自VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽和ADGN-100肽。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171016 FR 17/59645;20180417 FR 18/533701.用于细胞内递送mRNA的包含细胞穿透肽(CPP)和所述mRNA的mRNA递送复合物，其中所述细胞穿透肽选自VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽和ADGN-100肽。


2.用于细胞内递送mRNA的包含细胞穿透肽(CPP)和所述mRNA的mRNA递送复合物，其通过包含以下步骤的方法制备：
a)使包含所述mRNA的第一溶液与包含所述CPP的第二溶液混合以形成第三溶液，其中所述第三溶液包含或被调整以包含i)约0-5％蔗糖、ii)约0-5％葡萄糖、iii)约0-50％DMEM、iv)约0-80mMNaCl或v)约0-20％PBS；和
b)培育所述第三溶液以允许形成所述mRNA递送复合物。


3.用于细胞内递送mRNA的包含细胞穿透肽(CPP)和所述mRNA的mRNA递送复合物，其中所述mRNA编码治疗性蛋白。


4.用于细胞内递送mRNA的包含细胞穿透肽(CPP)和所述mRNA的mRNA递送复合物，其中所述mRNA递送复合物进一步包含RNAi。


5.权利要求4所述的mRNA递送复合物，其中所述mRNA编码用于治疗疾病或病症的治疗性蛋白，和其中所述RNAi靶向RNA，其中所述RNA的表达与所述疾病或病症相关。


6.权利要求1-5中任一项所述的mRNA递送复合物，其中所述细胞穿透肽是VEPEP-6肽或ADGN-100肽。


7.权利要求1-6中任一项所述的mRNA递送复合物，其中所述细胞穿透肽与所述mRNA共价连接。


8.权利要求1-7中任一项所述的mRNA递送复合物，其中所述细胞穿透肽包含与其N-末端共价连接的乙酰基基团。


9.权利要求1-8中任一项所述的mRNA递送复合物，其中所述细胞穿透肽包含与其C-末端共价连接的半胱酰胺基团。


10.权利要求1-9中任一项所述的mRNA递送复合物，其中所述mRNA递送复合物中的至少一些所述细胞穿透肽通过键与靶向部分连接。


11.权利要求1-10中任一项所述的mRNA递送复合物，其中所述细胞穿透肽与所述mRNA的摩尔比是约1：1和约100：1之间。


12.权利要求1-11中任一项所述的mRNA递送复合物，其中所述mRNA递送复合物的平均直径是约20nm和约1000nm之间。


13.包含核的纳米颗粒，所述核包含权利要求1-12中任一项所述的mRNA递送复合物。


14.权利要求12所述的纳米颗粒，其中所述核进一步包含根据权利要求1-12中任一项的一种或多种另外的mRNA递送复合物。


15.权利要求13或14所述的纳米颗粒，其中所述核进一步包含RNAi。


16.权利要求15所述的纳米颗粒，其中所述RNAi靶向癌基因，进行下调。


17.权利要求13-16中任一项所述的纳米颗粒，其中所述核由包含周围细胞穿透肽的壳包被。


18.权利要求17所述的纳米颗粒，其中所述周围细胞穿透肽选自PEP-1肽、PEP-2肽、PEP-3肽、VEPEP-3肽、VEPEP-6肽、VEPEP-9肽和ADGN-100肽。


19.药物组合物，其包含权利要求1-12中任一项所述的mRNA递送复合物或权利要求13-18中任一项所述的纳米颗粒，和药学上可接受的载体。


20.制备权利要求1-12中任一项所述的mRNA递送复合物的方法，其包含使所述细胞穿透肽与所述一种或多种mRNA组合，由此形成所述mRNA递送复合物。


21.权利要求20所述的方法，其中所述细胞穿透肽和所述mRNA分别以约1：1至约100：1的摩尔比组合。


22.权利要求20或21所述的方法，其中所述组合包含使包含所述mRNA的第一溶液与包含所述CPP的第二溶液混合以形成第三溶液，其中所述第三溶液包含或被调整以包含i)约0-5％蔗糖、ii)约0...

【专利技术属性】
技术研发人员：N·德赛，G·迪维塔，
申请(专利权)人：阿迪根有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US