筛选TCR的方法及其分离的TCR技术

本发明专利技术涉及一种筛选TCR的方法。方法包括：将第一细胞与第二细胞进行共培养处理，第一细胞表达单个HLA等位基因和多个抗原表位肽，第二细胞选自T细胞或含有T细胞的细胞群；将共培养处理后获得的第二细胞进行分选处理，得到分选细胞，分选细胞表达有与抗原表位肽结合的TCR，TCR为目标TCR；其中，第一细胞是通过将表达载体导入受体细胞后获得的，表达载体携带串联小基因，串联小基因编码所述多个抗原表位肽。该方法可单次获得多个特异性TCR，具有筛选效率高和筛选成本低等优点；尤其是当多个抗原表位肽来源于同一病毒或病原细胞时，得到的多个TCR均可特异性识别该病毒或病原细胞，具有筛选效率高等优点。筛选效率高等优点。

【技术实现步骤摘要】
筛选TCR的方法及其分离的TCR


[0001]本专利技术涉及免疫学领域，具体地，本专利技术涉及一种筛选TCR的方法及其分离的TCR，更具体地，本专利技术涉及一种筛选TCR的方法、分离的TCR、核酸分子、表达载体、重组细胞、药物组合物及其用途。

技术介绍

[0002]SARS
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CoV
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2属于β冠状病毒属，与严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS
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CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS
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CoV)分别具有80％和50％同源性。
[0003]冠状病毒的T细胞免疫疗法是指将与冠状病毒抗原具有高亲合力的特异性TCR基因转移到T细胞中，得到TCR
‑
T细胞，TCR
‑
T细胞所表达的TCR可特异性结合期望的冠状病毒相关抗原，从而激活T 细胞，特异性杀伤冠状病毒。
[0004]因此，筛选能够特异性靶向结合冠状病毒的TCR，是冠状病毒的T细胞免疫疗法成功的关键所在，并且该TCR匹配的抗原或抗原表位肽也可用于冠状病毒疫苗的制备。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本专利技术提供了一种筛选TCR的方法，基于此方法筛选出的TCR能够特异性识别和靶向结合新型冠状病毒。
[0006]本专利技术是基于专利技术人的下列发现而完成的：
[0007]冠状病毒的基因组编码四种结构蛋白，包括刺突(S)蛋白、核衣壳(N)蛋白、膜(M)蛋白和包膜(E)蛋。 S蛋白含有受体结合结构域(RBD)，可介导病毒附着在宿主细胞表面受体上，以及随后病毒与宿主细胞膜之间的融合，以促进病毒进入宿主细胞。S蛋白具有较大的胞外域，在疫苗设计中最受关注；而N、 M和E蛋白的研究相对较少，但也具有研究价值。M和E蛋白比S蛋白更保守，N蛋白是一种丰富且具有高度免疫原性的抗原，据报道，COVID
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19患者对来自SARS
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CoV的N蛋白的抗原具有交叉反应性。目前，出现了众多SARS
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CoV
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2感兴趣的变体(VOI)和关注的变体(VOC)，例如Alpha(B.1.1.7)、 Beta(B.1.351)、Gamma(P.1)、Delta(B.1.617.2)和Omicron(B.1.1.529)引起了人们对接种疫苗或康复人群的免疫逃逸的深切关注。有研究表明，一些突变体可以逃避现有的SARS
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CoV
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2中和抗体，尤其是Omicron 变体，因为识别主要在S蛋白的RBD区域介导，该区域具有高突变率。有研究表明，T细胞反应对许多变体具有交叉反应性，包括Omicron变体。还有研究发现，与抗体相比，从COVID
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19中恢复的个体中，特异性靶向SARS
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CoV
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2的T细胞可在一年内继续维持其功能，这表明特异性靶向SARS
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CoV
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2的 T细胞的持久性可能对长期免疫保护起到至关重要的作用。目前已鉴定出可介导SARS
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CoV
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2激活T细胞反应的表位，并且该表位可用作SARS
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Cov
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2疫苗以诱导SARS
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CoV
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2激活T细胞免疫。然而， SARS
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CoV
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2特异性TCR的序列以及其与SARS
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CoV
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2变体的交叉反应性并不清楚。
[0008]传统的鉴定SARS
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CoV
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2特异性TCR序列的方法主要是通过MHC呈递抗原预测算法
对新冠病毒抗原表位进行预测后合成抗原表位肽，利用合成的抗原表位肽对新冠康复病人单个核细胞(PBMC)样本进行体外刺激，获得特异性T细胞。之后通过合成MHC四聚体来鉴定特定的TCR序列。但是这种方法依赖于抗原表位肽的合成，花费成本较高；另外，纯化MHC四聚体工作量大，劳动力密集。因此，该方法存在工作量大和成本高等缺点，无法实现TCR序列的高效鉴定。
[0009]基于此，在本专利技术的一个方面，本专利技术提出了一种筛选TCR的方法。根据本专利技术的实施例，所述方法包括：将第一细胞与第二细胞进行共培养处理，所述第一细胞表达单个HLA等位基因和多个抗原表位肽，所述第二细胞选自T细胞或含有T细胞的细胞群；将共培养处理后获得的第二细胞进行分选处理，得到分选细胞，所述分选细胞表达有与所述抗原表位肽结合的TCR，所述TCR为目标TCR；其中，所述第一细胞是通过将表达载体导入受体细胞后获得的，所述表达载体携带串联小基因，所述串联小基因编码所述多个抗原表位肽。根据本专利技术实施例的筛选TCR的方法可获得特异性靶向抗原表位肽的TCR，该方法中的第一细胞中含有多个抗原表位肽，其可单次获得多个TCR，具有筛选效率高和筛选成本低等优点；并且，获得的TCR可特异性识别抗原表位肽，尤其是当多个抗原表位肽来源于同一病毒或病原细胞时，该方法得到的多个TCR均可特异性识别该病毒或病原细胞，具有筛选效率高等优点。
[0010]在本专利技术的另一方面，本专利技术提出了一种分离的TCR。根据本专利技术的实施例，所述分离的TCR包括：TCRα链可变区和TCRβ链可变区；所述TCRα链可变区包括选自下列至少之一的CDR3序列：SEQID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:75、 SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:105和SEQ ID NO:111；或，所述TCRβ链可变区包括选自下列至少之一的CDR3序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:108和SEQ ID NO:114。根据本专利技术实施例的分离的TCR 均可特异性识别SARS
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CoV
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2，并且，该分离的TCR对具有相当激活水平的突变抗原具有交叉反应性，能够识别和结合SARS
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CoV
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2变体，杀伤本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种筛选TCR的方法，其特征在于，包括：将第一细胞与第二细胞进行共培养处理，所述第一细胞表达单个HLA等位基因和多个抗原表位肽，所述第二细胞选自T细胞或含有T细胞的细胞群；将共培养处理后获得的第二细胞进行分选处理，得到分选细胞，所述分选细胞表达有与所述抗原表位肽结合的TCR，所述TCR为目标TCR；其中，所述第一细胞是通过将表达载体导入受体细胞后获得的，所述表达载体携带串联小基因，所述串联小基因编码所述多个抗原表位肽。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述串联小基因编码8～11个所述抗原表位肽；任选地，所述抗原表位肽选自具有8～11氨基酸的肽段；任选地，所述多个抗原表位肽预先通过MHC呈递抗原预测软件预测获得；任选地，所述多个抗原表位肽预先经过筛选处理获得；优选地，所述多个抗原表位肽与所述单个HLA等位基因所编码的MHC具有亲和力是所述多个抗原表位肽为目标抗原表位肽的指示；任选地，所述共培养处理包括：将所述第一细胞和所述第二细胞在不含IL
‑
2的培养基中进行第一共培养处理；将经过所述第一共培养处理的细胞在含IL
‑
2的培养基中进行第二共培养处理；将经过所述第二共培养处理的细胞在不含IL
‑
2的培养基中进行第三共培养处理；任选地，所述第一共培养处理中，所述第一细胞与所述第二细胞的起始细胞数比为1:(25～35)；任选地，所述第一共培养处理中多次加入所述第一细胞；任选地，所述第一共培养处理的处理时间为8
‑
10d；任选地，所述第二共培养处理中，所述第一细胞与所述第二细胞的细胞数比为1:(3～5)；任选地，所述第二共培养处理的处理时间为4
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5d；任选的，所述第二细胞表达有41BB是分选细胞的指示；任选地，所述第二共培养处理中，所述IL
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2在所述培养基中的添加量为20～100IU/mL；任选地，所述第三共培养处理中，所述第一细胞与所述第二细胞的细胞数比为1:(3～5)；任选地，进一步包括将所述分选细胞的TCR进行测序处理，获得多个所述目标TCR序列；任选地，所述测序处理是通过10X Genomics单细胞测序技术进行的；任选地，所述测序处理包括分别对混合的所述分选细胞和混合的阴性细胞进行测序，所述阴性细胞选自经过不表达抗原表位肽的第一细胞刺激的第二细胞；任选地，所述TCR与新型冠状病毒抗原结合；任选地，所述第二细胞来源于经过新型冠状病毒感染的个体；任选地，所述第二细胞选自外周血单个核细胞；任选地，所述新型冠状病毒抗原包括选自具有SEQ ID NO:229～256任一项所示氨基酸序列的抗原表位肽中的至少之一。3.一种分离的TCR，其特征在于，包括：TCRα链可变区和TCRβ链可变区；
所述TCRα链可变区包括选自下列至少之一的CDR3序列：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:105和SEQ ID NO:111；或所述TCRβ链可变区包括选自下列至少之一的CDR3序列：SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:108和SEQ ID NO:114。4.根据权利要求3所述的分离的TCR，其特征在于，所述TCRα链可变区进一步包括选自下列至少之一的CDR1序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:103和SEQ ID NO:109；任选地，所述TCRα链可变区进一步包括选自下列至少之一的CDR2序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:104和SEQ ID NO:110；任选地，所述TCRβ链可变区包括选自下列至少之一的CDR1序列：SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:106和SEQ ID NO:112；任选地，所述TCRβ链可变区包括选自下列至少之一的CDR2序列：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:107和SEQ ID NO:113。任选地，所述TCRα链可变区包括：分别如SEQ ID NO:1
‑
3的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:7
‑
9的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:13
‑
15的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:19
‑
21的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:25
‑
27的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:31
‑
33的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:37
‑
39的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:43
‑
45的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:49
‑
51的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:55
‑
57的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:61
‑
63的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:67
‑
69的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；
分别如SEQ ID NO:73
‑
75的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:79
‑
81的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:85
‑
87的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:91
‑
93的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:97
‑
99的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；分别如SEQ ID NO:103
‑
105的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分别如SEQ ID NO:109
‑
111的氨基酸序列所示的CDR1、CDR2、CDR3序列；任选地，所述TCRβ链可变区包括：分别如SEQ ID...

【专利技术属性】
技术研发人员：蓝勋，林欣，黄爱龙，唐霓，王莉惠，许润达，黄道盛，孙克用，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：