肽聚糖识别蛋白-3及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了肽聚糖识别蛋白

【技术实现步骤摘要】
肽聚糖识别蛋白
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3及其制备方法和应用

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[0001]本专利技术属于生物医药
，涉及肽聚糖识别蛋白
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3的结构及其获得方法与应用。具体地说，本专利技术涉及肽聚糖识别蛋白
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3及其类似物、活性片段的结构及其制备生产方法与功能，以及其在微生物及其相关分子模式检测诊断、影响合成抗菌肽等生物医药领域中的应用，制备肽聚糖识别蛋白
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3及其类似物或活性片段的抗体及其在生物医药领域的应用。

技术介绍
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[0002]先天免疫系统的激活是通过一系列高度保守的模式识别受体识别病原体相关分子模式。肽聚糖识别蛋白(Peptidoglycan recognition protein，PGRP)家族是重要的模式识别受体，从昆虫到人类均高度保守，可识别肽聚糖和含肽聚糖的细菌，在先天免疫和获得性免疫应答中发挥重要的识别和调节功能。昆虫肽聚糖识别蛋白作为模式识别受体(pattern recognition receptor，PPR)家族的一员，可识别仅存在于病原生物表面的病原相关分子模式(pathogen
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related molecular patterns，PAMPs)实现对外来病原物的感知，进而选择性激活Toll途径、IMD途径、JAK
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STAT途径、活性氧代谢或者黑化反应等途径清除病原物。
[0003]1996年，Yoshida等(Yoshida,H.；Kinoshita,K.；Ashida,M.Purification of a Peptidoglycan Recognition Protein from Hemolymph of the Silkworm,Bombyx Mori.J.Biol.Chem.1996,271(23),13854
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13860.https://doi.org/10.1074/jbc.271.23.13854.)从家蚕血液中纯化得到一个具有信号肽、等电点为6.5、分子量为19kD的肽聚糖识别蛋白，也是生物界最早从昆虫中得到的小型肽聚糖识别蛋白。该蛋白存在于家蚕的血淋巴和表皮中，对肽聚糖和革兰氏阳性菌具有较高结合活性，体外结合试验结果表明，该肽聚糖识别蛋白结合肽聚糖以后能够激活酚氧化酶原系统。随后又从其他昆虫和哺乳动物中克隆得到肽聚糖识别蛋白基因，到目前为止，除后口动物和植物外，已经发现了近100种肽聚糖识别蛋白受体。
[0004]肽聚糖识别蛋白都具有一个大小约165个氨基酸残基的保守肽聚糖结合结构域，该结构域序列和微生物的T7溶菌酶具有30％的相似性。就像T7溶菌酶一样，具有酰胺酶活力的PGRP通过切开L
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型肽聚糖的桥链而水解肽聚糖，另一部分肽聚糖识别蛋白因缺少一个结合锌离子的半胱氨酸而不能水解肽聚糖。昆虫的肽聚糖识别蛋白在如血细胞、脂肪体和中肠等免疫器官中均有表达，且很多都能被肽聚糖或细菌诱导上调表达，暗示其在抗菌反应中起到很重要的作用。
[0005]肽聚糖识别蛋白识别细菌细胞壁的PGN能够激活Toll受体，从而起始Toll信号通路。Toll信号通路的激活使得昆虫体内一些抗菌肽基因表达，产生的抗菌肽在对抗革兰阳性菌及真菌感染中发挥着重要作用。Toll信号通路主要被来自于革兰阳性菌细胞壁的Lys
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type PGN激活，但对于来自于革兰阴性菌细胞壁的Dap
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type PGN的刺激也有弱的响应。Immune Deficiency(IMD)信号通路是PGRPs参与的昆虫体内的第2条信号通路，目前已知在
果蝇体内具有酰胺酶活性的PGRPs通过降解PGN，控制免疫反应的强度，如PGRP
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LB、PGRP
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SC1与PGRP
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SC2对果蝇的IMD信号通路有负调控作用，这种负调控作用可以调整对革兰阴性菌感染的免疫反应。酚氧化酶原反应的信号通路是PGRPs参与的昆虫体内的第3条信号通路，PGRPs与PGN结合激活酚氧化酶原反应，促使伤口愈合以及黑色素的产生。
[0006]肽聚糖识别蛋白是为数不多的从低等动物到高等动物都非常保守的模式识别蛋白，对了解宿主免疫调控和免疫相关疾病研究有重要意义。
[0007]目前尚未见对鳞翅目(Lepidoptera)的天(大)蚕蛾科昆虫肽聚糖识别蛋白
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3的结构、制备、生物学功能及其应用的相关研究。

技术实现思路
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[0008]本专利技术是针对鳞翅目的天(大)蚕蛾科昆虫体内的PGRP
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3，研究天然PGRP
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3的制备方法、一级结构(基因和蛋白质)、生物学功能以及其应用，利用基因工程技术获得重组PGRP
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3及其类似物或活性片段以及其生物学功能和应用。此外，利用天然、重组PGRP
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3及其类似物或活性片段作为抗原，刺激机体产生抗体，同时研究了该抗体的应用。
[0009]本专利技术首先利用蛋白提取、分离、纯化技术，从鳞翅目天(大)蚕蛾科昆虫中分离、纯化获得天然PGRP
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3。其次，利用蛋白质化学技术以及分子生物学技术，解析PGRP
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3的一级结构(基因和蛋白质)并获得其基因。再次，利用基因工程技术，实现PGRP
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3基因在宿主细胞的表达，结合蛋白提取、分离、纯化技术获得重组PGRP
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3。同时，利用基因重组技术，获得PGRP
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3的类似物或部分片段。天然、重组PGRP
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3以及其类似物或部分片段能特异性识别细菌、真菌等微生物，并影响抗菌肽的合成。本专利技术的天然、重组PGRP
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3以及其类似物或部分片段以及其抗体的生物学功能，可广泛应用于针对微生物的预防、检测诊断、治疗等生物医药领域；同时，利用本专利技术的天然、重组PGRP
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3以及其类似物或部分片段诱导昆虫大量表达抗菌肽，由此制备获得的抗菌肽可应用于微生物的预防、检测诊断、治疗等生物医药领域。包括1.针对微生物的预防、检测诊断、治疗等生物医药领域应用；2.针对微生物相关分子模式的预防、检测诊断、治疗等生物医药领域应用；3.针对天然肽聚糖识别蛋白
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3、重组肽聚糖识别蛋白
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3、重组肽聚糖识别蛋白
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3类似物或活性片段的检测与追踪等生物医药领域应用；4.影响抗菌肽合成及其获得的抗菌肽在生物医药领域应用。
[0010]本专利技术所指昆虫是鳞翅目昆虫，鳞翅目昆虫优选天(大)蚕蛾科(Saturniidae)昆虫，选自柞蚕、蓖麻蚕、天蚕、印度柞蚕、琥珀蚕、美国柞蚕、樗蚕、大山蚕、美洲天蚕、樟蚕、枫蚕，昆虫为任何地域的天然或人工放养或人工饲养的昆虫。为使本专业技术人员更全面、清晰理解本专利技术，以柞蚕作为代表来描述下面的内容，而选择柞蚕作为代表来描述并不是以任何方式限制本专利技术权利要求的范围。
[0011]本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肽聚糖识别蛋白
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3，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.根据权利要求1所述的肽聚糖识别蛋白
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3，其特征在于，所述的肽聚糖识别蛋白
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3来源于鳞翅目(Lepidoptera)天(大)蚕蛾科(Saturniidae)昆虫，选自柞蚕、蓖麻蚕、天蚕、印度柞蚕、琥珀蚕、美国柞蚕、樗蚕、大山蚕、美洲天蚕、樟蚕、枫蚕中的一种。3.编码权利要求1或2所述的肽聚糖识别蛋白
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3的基因。4.根据权利要求3所述的肽聚糖识别蛋白
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3的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。5.权利要求1或2所述的肽聚糖识别蛋白
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3的衍生物或类似物或活性片段，其特征在于，包含氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示全部序列或部分序列，且具有肽聚糖识别蛋白
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3的生物学活性。6.根据权利要求5所述的肽聚糖识别蛋白
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3的衍生物或类似物或活性片段，其特征在于，所述的肽聚糖识别蛋白
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3的衍生物或类似物或活性片段选自Met
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PGRP
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3序列、Met
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His6标签
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PGRP
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3序列、Met
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PGRP
‑3‑
His6标签序列、Met
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His6标签
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凝血酶酶切位点
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PGRP
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3序列、Met
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GST标签
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凝血酶酶切位点
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PGRP
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3序列、Met
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PGRP
‑3‑
凝血酶酶切位点
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GST标签序列、Met
‑
PGRP
‑3‑
Flag标签序列、Met
‑
Flag标签
‑...

【专利技术属性】
技术研发人员：张嵘，王夏璐，张景海，
申请(专利权)人：沈阳药科大学，
类型：发明
国别省市：