一种可以标记动物体内TNF-α表达的方法以及模型技术

本发明专利技术提供了一种可以跟踪小鼠内源性TNF

【技术实现步骤摘要】
一种可以标记动物体内TNF
‑
α
表达的方法以及模型


[0001]本专利技术属于医药领域，具体涉及一种可以标记动物体内TNF
‑
α表达及模型。

技术介绍

[0002]肿瘤坏死因子
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α(Tumor Necrosis Factor，TNF
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α)是一种促炎症的细胞因子，由活化的单核细胞/巨噬细胞(包括中枢神经系统(CNS)的小胶质细胞)、活化的NK和T细胞表达，但也由各种非免疫细胞如内皮细胞和成纤维细胞表达。TNF
‑
α最初以其对肿瘤细胞具有毒性而命名，但最近的研究发现，在一些情况下TNF
‑
α可以参与肿瘤炎性微环境的形成，促进肿瘤新生血管增生、原发肿瘤的生长和转移。TNF
‑
α的不当表达和众多自身免疫疾病相关，包括克罗恩病、溃疡性结肠炎、类风湿关节炎、强直性脊柱炎等，因此TNF
‑
α已成为这类疾病最重要的药物靶点之一，抗TNF
‑
α抗体已被成功用于这些疾病的治疗。尽管TNF
‑
α抗体或其受体融合蛋白已成功上市，但这些药物依然具有治疗费用高、跨血脑屏障能力差的缺点，同时也有较大的副作用。从TNF
‑
α表达水平构建药物筛选体系用于包括小分子药物、核酸药物的筛选具有重要的应用价值。传统上，体外培养的细胞系常用于这类筛选模型的构建，但这些细胞系经过永生化过程和长期体外培养已和自然状况下的体内组织细胞显著不同，在TNF/>‑
α表达的信号传导和基因调控方式上具有重大差异，因此基于这些细胞开展的药物筛选常常面临很大的失败风险。
[0003]生物活体光学成像技术是指在生物体内利用荧光素酶等分子作为标记物对组织、细胞和基因进行标记，通过对标记物进行定性和定量分析，实现对特定生物学过程和生物分子的实时体内跟踪一类技术。目前，荧光素酶基因是生物发光成像技术最为常用的标记基因，现已广泛应用于炎症反应、肿瘤标记等研究中。其中较为常用的荧光素酶报告基因是萤火虫荧光素酶基因(Firefly Luciferase)，由554个氨基酸构成，约50kD。荧光素酶通过ATP、氧和Mg
2+
存在条件下催化氧化荧光素(Luciferin)，进而释放生物荧光。这种生物体发光不需要激发光，且穿透力强、灵敏度高、无激发光的非特异干扰。因此，有待将生物光学成像技术应用于TNF
‑
α基因表达检测中。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了一种可以跟踪小鼠内源性TNF
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α基因表达的基因修饰动物模型，在这个模型中，荧光素酶(Luciferase)编码基因被插入到小鼠TNF
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α基因的特定位置，从而在小鼠体内的细胞中伴随TNF
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α的表达和表达出同样分子的荧光素酶RNA分子，进而被翻译成荧光素酶蛋白，给予这类小鼠荧光素酶底物(荧光素)就可以检测到荧光素酶催化荧光素氧化而发出的光子，通过检测光子发射的强度和部位，可以获得小鼠体内TNF
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α基因表达的部位和表达强度。
[0005]所述小鼠模型可以应用到和TNF
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α相关的生命科学研究以及药物的研发中。由于这一模型具有反映TNF
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α在体内响应生理和病理信号的真实过程、检测方法简便灵敏、可以在同一活体上反复测试，因此相较于传统动物模型上测试TNF
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α的方法具有显著的优势。
[0006]根据所述动物模型，可获得相应的原代细胞，实现在体外培养的细胞层面上对TNF
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α基因表达进行检测、研究以及相关药物分子的筛选，克服了传统的细胞系不能模拟自然细胞功能的缺陷。
附图说明
[0007]图1 C57BL/6JSmoc
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Tnf
em4(IRES
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Luciferase)Smoc
小鼠构建技术流程图
[0008]图2打靶载体结构图。
[0009]图3基因修饰小鼠鉴定示意图
[0010]图4阳性小鼠鉴定结果。其中，16号和23号PCR鉴定为正确的阳性小鼠。
[0011]图5 C57BL/6JSmoc
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Tnf
em4(IRES
‑
Luciferase)Smoc
小鼠用于检测LPS诱导的TNF
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α的表达。
[0012]图6 C57BL/6JSmoc
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Tnf
em4(IRES
‑
Luciferase)Smoc
小鼠用于检测地塞米松对LPS诱导的TNF
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α表达的抑制。
具体实施方式
[0013]下面结合具体实施例和附图对本专利技术进行进一步的阐述。
[0014]实施例1基因修饰小鼠品系建立
[0015](1)编码荧光素酶基因序列的5
’
端含有IRES序列共同组成荧光素酶的表达框，如图1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述的表达框片段两侧含有和TNF
‑
α基因终止密码子及3
’
UTR区域上下游同源的序列，共同形成同源重组片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述的同源重组片段被克隆到pBR322质粒中获得打靶载体，如图2；
[0016](2)gRNA选取的位置为邻近TNF
‑
α终止密码子的区域，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；
[0017](3)将包含gRNA的TNF
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α基因编辑体系和打靶载体注射到小鼠受精卵中，实现在TNF
‑
α基因终止密码子位点3
’
下游定点敲入IRES
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Luciferase表达框，并将注射后的受精卵移植到雌性受体小鼠输卵管中使其怀孕和发育获得基因修饰的小鼠品系(如图3)，该小鼠品系命名为：C57BL/6JSmoc
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Tnf
em4(IRES
‑
Luciferase)Smoc
。阳性小鼠鉴定结果见图4，16号和23号PCR鉴定为正确的阳性小鼠。
[0018]实施例2 C57BL/6JSmoc
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Tnf
em4(IRES
‑
Luciferase)Smoc
小鼠的应用验证
[0019]动物体内注射细菌脂多糖(LPS)可以引发全身性的炎症反应，其中TNF
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α的表达会被迅速激活。通过对C57BL/6JSmoc
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Tnf
em4(IRES
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Luciferase)Smoc
小鼠腹腔注射LPS(0.3mg/mL，10倍体重注射)，并通过活体成像检测到不同时间点小鼠荧光素酶活力的变本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种打靶载体，其特征在于：通过In
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Fusion技术将TNF
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α基因片段和IRES
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Luciferase基因片段与pBR322质粒无缝克隆连接后获得，所述TNF
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α基因片段如SEQ ID No:1所示，所述IRES
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Luciferase基因片段如SEQ ID NO:2所示。2.如权利要求1所述的打靶载体，其特征在于，所述打靶载体包含SEQ ID NO:3所示的基因片段。3.一种建立标记动物体内TNF
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α表达模型的方法，其特征在于：在动物基因组导入权利要求1或2所述的打靶载体，所述动物为小鼠。4.一种可以将DNA片段导入到动物基因组中TNF
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α基因特定位置的方法，其特征是设计一段和TNF
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α基因序列同源的gRNA或者表达该gRNA的DNA并和Crispr/Cas9蛋白或者编码该蛋白的RNA或者DNA共同组成TNF
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α基因编辑体系，步骤如下：(1)编码荧光素酶基因序列的5
’
端含有IRES序列共同组成荧光素酶的表达框，所述的表达框片段两侧含有和TNF
‑
α基因终止密码子及3
’
UTR区域上下游同源的序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：费俭，邵方洋，
申请(专利权)人：同济大学，
类型：发明
国别省市：