密码子优化NSP15基因诱导果蝇器官发育缺陷、构建模型及筛选抗新冠病毒药物的应用制造技术

本发明专利技术涉及分子生物学和基因工程技术领域，具体提供一种密码子优化NSP15基因在诱导果蝇器官发育缺陷中的应用、以及基于果蝇器官发育缺陷而构建筛选抗新冠病毒药物的转基因果蝇模型和筛选抗新冠病毒药物的方法。通过诱导，该密码子优化的NSP15基因能在果蝇的不同器官过表达，导致果蝇器官出现肉眼可见的发育缺陷，合理的选择器官发育缺陷便于观察的转基因果蝇品系作为模型，能够低成本且快速的筛选或评估治疗NSP15蛋白过量表达引起的相关疾病的药物，尤其是新冠病毒治疗药物的效果，从而有效弥补基于计算生物学筛选和基于培养细胞筛选方式存在的不足。筛选方式存在的不足。筛选方式存在的不足。

【技术实现步骤摘要】
密码子优化NSP15基因诱导果蝇器官发育缺陷、构建模型及筛选抗新冠病毒药物的应用


[0001]本专利技术涉及分子生物学和基因工程
，具体提供一种密码子优化NSP15基因在诱导果蝇器官发育缺陷的应用、以及基于果蝇器官发育缺陷而构建筛选抗新冠病毒药物的转基因果蝇模型和筛选抗新冠病毒药物的方法。

技术介绍

[0002]SARS
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CoV
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2病毒所引起的COVID
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19已成为本世纪最严重的全球性传染病，对经济、社会、政治产生了重大影响。研发针对SARS
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CoV
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2的特效药以阻断与治疗新冠刻不容缓。
[0003]SARS
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CoV
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2基因组约为30kb，含有4个结构性蛋白和大约15个非结构性蛋白，其中非结构性蛋白在SARS
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CoV
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2的生活史中扮演重要角色。NSP15作为新冠病毒的一种保守的非结构性蛋白，能够六聚化形成六聚体形式的大型蛋白复合体。在所有冠状病毒家族成员中都发现有NSP15样非结构性蛋白，该非结构性蛋白具有高度保守性；并且NSP15具有核糖核酸内切酶功能，对病毒基因组复制以及病毒的免疫逃逸具有重要作用，是开发治疗新冠药物的有效靶点，因而针对NSP15的药物开发具有重要意义。
[0004]现有的针对新冠病毒蛋白NSP15的药物筛选手段主要有两种：基于计算生物学的筛选和基于培养细胞的筛选。基于计算生物学的筛选存在较多的假阳性且需要实验室验证；而基于培养细胞的筛选价格昂贵，并且筛选过程细胞处于是离体状态，难以模拟新冠病毒蛋白NSP15及药物作用于多细胞生物体的情况。
[0005]由于高水平的基因和信号的保守性，果蝇与哺乳动物之间在细胞生理生化过程中存在一定的相似性。在发育遗传学、信号转导和细胞生物学中常采用转基因果蝇建立实验模型研究人类基因，经过实践证明，利用转基因果蝇模型研究多种疾病机理具有许多独到的优势。

技术实现思路

[0006]本专利技术基于分子克隆、转基因、果蝇Gal4/UAS系统、果蝇杂交等技术，设计并构建了一种筛选抗新冠病毒药物的转基因果蝇模型，其能够低成本且快速的筛选或评估治疗NSP15蛋白过量表达引起的相关疾病的药物，尤其是潜在的以NSP15蛋白为靶点的新冠病毒治疗药物的效果，从而有效弥补上述两种筛选手段的不足。
[0007]首先，本专利技术通过对NSP15蛋白对应的碱基序列进行了密码子优化，使其能够在果蝇中顺利稳定表达，所述密码子优化NSP15基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。基于果蝇Gal4/UAS系统，使得密码子优化NSP15非结构性蛋白能够在果蝇特定器官中表达。通过与一系列不同类型的Gal4品系果蝇杂交，密码子优化NSP15基因在对应子代果蝇的不同的对应器官中过表达，故我们能够对应获得多种不同类型的子代果蝇，这些子代果蝇都对应有不同的肉眼可见器官缺陷，可以据这些子代果蝇的器官缺陷特征建立多种不同类型的转基因
果蝇模型。并且，我们能从中进一步筛选出若干种性状缺陷可辨别性更强的类型，并可以以这些类型的转基因果蝇模型为基础，建立能够筛选以NSP15蛋白为靶点的抗新冠病毒药物的稳定目标品系转基因果蝇模型。
[0008]作为潜在辅助手段，除了进行以NSP15为靶点的抗新冠病毒药物筛选外，还可以此果蝇模型筛选NSP15过量表达相关疾病进程中的关键信号通路及其药物；或筛选与NSP15相互作用的蛋白及其药物。
[0009]本专利技术提供了如下的完成构建筛选抗新冠病毒药物的转基因果蝇模型的方法，其通过以下步骤进行：步骤(1)：重组载体质粒的构建：将新型冠状病毒(SARS
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CoV
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2)非结构性蛋白NSP15基因的碱基序列进行密码子优化，合成碱基序列如SEQ ID NO.1所示的密码子优化NSP15基因，并制备包含有所述密码子优化NSP15基因的重组载体质粒；步骤(2)：纯合初代转基因果蝇的培育：将所述重组载体质粒注入至果蝇胚胎/果蝇受精卵中，在发育至成虫后通过进一步筛选及杂交，获得三号染色体定点插入所述密码子优化NSP15基因的纯合UAS
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NSP15初代转基因果蝇；步骤(3)：稳定目标品系转基因果蝇的培育：利用Gal4/UAS系统，将步骤(2)获得的纯合UAS
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NSP15初代转基因雄性果蝇与Gal4品系处女果蝇进行杂交，使得密码子优化NSP15基因在子代果蝇的器官中过表达，从所述子代果蝇中筛选出若干种肉眼可见器官发育缺陷的，并且保留生殖能力的特种Gal4/UAS品系果蝇；将各种所述特种Gal4/UAS品系处女果蝇与平衡系雄性果蝇杂交，获得重组果蝇；去除重组果蝇三号染色体的平衡染色体后，获得所述稳定目标品系转基因果蝇，所述稳定目标品系转基因果蝇具有肉眼可见的器官发育缺陷。
[0010]进一步的，所述步骤(3)中，利用果蝇Gal4/UAS系统，通过选择的纯合UAS
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NSP15初代转基因雄性果蝇与不同Gal4品系处女果蝇进行杂交。通过不同Gal4的诱导，使果蝇在不同的器官表达NSP15蛋白而发挥了诱导果蝇器官发育缺陷的效果。通过上述杂交，我们获得了既有明显肉眼可见器官发育缺陷的表型，又能构建稳定品系的Gal4/UAS组合。该组合在构建筛选抗新冠病毒药物的转基因果蝇模型的应用中具有重要意义。尤其在选用nubbin
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Gal4品系处女果蝇作为与纯合UAS
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NSP15初代转基因雄性果蝇杂交的品种后，杂交子代的果蝇呈现肉眼明显可见的翅膀发育缺陷，我们将其标示为nubbin
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Gal4/UAS品系果蝇。相对于果蝇其他器官发育缺陷的表型而言，翅膀缺陷及其性状的回复易于肉眼观察，且翅膀缺陷对果蝇的正常活动，如取食、生殖等活动等，无显著影响，便于大规模培养与筛选；在此基础上，本专利技术在实验中发现，采用下述方式构建筛选抗新冠病毒药物的转基因果蝇模型，能够更为稳定地获取用于针对NSP15进行药物筛选的稳定遗传并可大量繁殖的转基因果蝇品系，具体的：在步骤(1)中，将所述密码子优化NSP15基因插入至果蝇表达载体pUAST
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attB中，所述重组载体质粒为包含有密码子优化NSP15基因的pUAST
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attB
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NSP15重组载体质粒；在步骤(2)中，将所述pUAST
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attB
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NSP15重组载体质粒注入至白眼果蝇胚胎/果蝇受精卵中，所述纯合UAS
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NSP15初代转基因果蝇为基因型为NSP15初代转基因果蝇为基因型为的纯合初代转基因果蝇；
在步骤(3)中，所述nubbin
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Gal4品系处女果蝇为基因型为Gal4品系处女果蝇为基因型为的处女果蝇，所述nubbin
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Gal4/UAS品系果蝇为基因型为Gal4/UAS品本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.密码子优化NSP15基因在诱导果蝇器官发育缺陷中的应用，其特征在于：所述密码子优化NSP15基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。2.密码子优化NSP15基因在诱导果蝇翅膀发育缺陷中的应用，其特征在于：所述密码子优化NSP15基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。3.密码子优化NSP15基因在构建筛选抗新冠病毒药物的转基因果蝇模型中的应用，其特征在于：所述密码子优化NSP15基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。4.一种构建筛选抗新冠病毒药物的转基因果蝇模型的方法，其特征在于以下步骤：步骤(1)：重组载体质粒的构建：将新型冠状病毒(SARS
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CoV
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2)非结构性蛋白NSP15基因的碱基序列进行密码子优化，合成碱基序列如SEQ ID NO.1所示的密码子优化NSP15基因，并制备包含有所述密码子优化NSP15基因的重组载体质粒；步骤(2)：纯合初代转基因果蝇的培育：将所述重组载体质粒注入至果蝇胚胎/果蝇受精卵中，在发育至成虫后通过进一步筛选及杂交，获得三号染色体定点插入所述密码子优化NSP15基因的纯合UAS
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NSP15初代转基因果蝇；步骤(3)：稳定目标品系转基因果蝇的培育：利用Gal4/UAS系统，将步骤(2)获得的纯合UAS
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NSP15初代转基因雄性果蝇与多种Gal4品系处女果蝇进行杂交，使得密码子优化NSP15基因在子代果蝇的器官中过表达，从所述子代果蝇中筛选出若干种肉眼可见器官发育缺陷的，并且保留生殖能力的特种Gal4/UAS品系果蝇；将各种所述特种Gal4/UAS品系处女果蝇与平衡系雄性果蝇杂交，获得重组果蝇；去除重组果蝇三号染色体的平衡染色体后，获得所述稳定目标品系转基因果蝇，所述稳定目标品系转基因果蝇具有肉眼可见的器官发育缺陷。5.如权利要求4所述一种构建筛选抗新冠病毒药物的转基因果蝇模型的方法，其特征在于：所述步骤(3)中，所述Gal4品系处女果蝇为nubbin
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Gal4品系处女果蝇，所述特种Gal4/UAS品系果蝇为肉眼可见翅膀发育缺陷的nubbin
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Gal4/UAS品系果蝇。6.如权利要求5所述一种构建筛选抗新冠病毒药物的转基因果蝇模型的方法，其特征在于：所述步骤(1)中，将所述密码子优化NSP15基因插入至果蝇表达载体pUAST
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attB中，所述重组载体质粒为包含有密码子优化NSP15基因的pUAST
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attB
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【专利技术属性】
技术研发人员：谢晓俊，王诗涵，黄晓莹，
申请(专利权)人：汕头大学医学院，
类型：发明
国别省市：