一种基于人工合成寡核苷酸有效抑制HIV-1病毒组装的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于人工合成寡核苷酸有效抑制HIV

【技术实现步骤摘要】
一种基于人工合成寡核苷酸有效抑制HIV
‑
1病毒组装的方法


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及一种可在活细胞中有效干扰HIV
‑
1病毒组装的方法。

技术介绍

[0002]I型人类免疫缺陷病毒(HIV
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1)的组装和释放过程是其生命周期的重要阶段，该过程主要由Gag蛋白质介导，Gag以病毒RNA分子作为骨架，在细胞膜上发生聚合，组装形成病毒颗粒后从宿主细胞的细胞膜释放。迄今为止，有大量研究结果证明Gag
‑
RNA相互作用对于病毒组装具有关键作用，细胞膜上组装中的Gag分子能够与多种RNA发生相互作用，包括病毒RNA和细胞内源的RNA(Selective and nonselective packaging of cellular RNAs in retrovirus particles.(J Virol.2007；81(12):6623
‑
6631.))等。体外水溶液实验显示，在一定的RNA长度范围内，与Gag互作的RNA越长，Gag组装的程度越强(Self
‑
assembly in vitro of purified CA
‑
NC proteins from Rous sarcoma virus and human immunodeficiency virus type 1(J Virol.1995；69(10):6487
‑
6497.))。
[0003]2014年，Chen等提出了利用天然小RNA阻断病毒颗粒组装的概念。研究发现，细胞普遍存在的微小RNA(miRNA)分子能够结合Gag蛋白，扰乱Gag在病毒RNA上的多聚化过程，造成病毒颗粒组装失败。这些组装失败的Gag蛋白将被宿主细胞以内吞的途径运输到细胞质中，在溶酶体内进行降解(MicroRNA binding to the HIV
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1 Gag protein inhibits Gag assembly and virus production(Proc Natl Acad Sci U S A.2014 Jul 1；111(26):E2676
–
E2683.))。2017年，Qu等进一步揭示了自噬在miRNA
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Gag相互作用抑制病毒组装过程中的作用(Inhibition of retroviral Gag assembly by non
‑
silencing miRNAs promotes autophagic viral degradation(Protein Cell.2018；9(7):640
–
651.))。
[0004]尽管具备上述优点，miRNA在用于抑制病毒组装时仍存在一些问题。例如，需要对细胞进行过表达miRNA的实验，但难以控制miRNA的表达量；所选miRNA局限于生物内源的分子种类，因此序列、结构、碱基构成、分子大小和化学修饰类型有限。
[0005]RNA分子碱基互补的特性可以帮助核酸链自组装形成复杂的纳米结构，作为一种天然的生物材料具有可修饰性高、热稳定性好、生物安全性高等优势。研究者已证实可基于碱基的互补特性设计多个核酸链，使其在水溶液中自组装形成大小可控的RNA纳米颗粒，并证实某些RNA颗粒可在细胞中甚至活体内具有生物学功能。目前，使用特殊RNA序列或结构作为自组装材料已经成为一个快速发展的研究领域(Advancement of the emerging field of RNA nanotechnology(ACS Nano.2017；11(2):1142
‑
1164.))。

技术实现思路

[0006]针对上述用miRNA抑制病毒组装的不足之处，本专利技术设计了一系列人工合成的RNA寡核苷酸，发现Gag蛋白在细胞膜上对茎环结构的RNA寡核苷酸具有结合倾向性，且该结合可以干扰病毒组装。将此概念引入设计可自组装的RNA原件，得到空间结构更加复杂、具有
多个茎环结构的RNA自组装纳米材料，进一步提升人工合成的RNA寡核苷酸对HIV
‑
1病毒组装的抑制效果。
[0007]具体的，本专利技术首先提供了一种可有效结合HIV
‑
1结构蛋白Gag分子的人工合成茎环结构寡核苷酸，这种寡核苷酸可通过自组装(Controllable self
‑
assembly of RNA tetrahedrons with precise shape and size for cancer targeting(Adv Mater.2016；28(34):7501
‑
7.))的方法建立空间结构更加复杂的RNA自组装纳米材料。
[0008]可自组装成具有多个茎环结构的RNA自组装纳米材料的RNA寡核苷酸可以是具有如下特征的寡核苷酸链：
[0009]1、具有茎环结构，在茎环结构的5
’
或3
’
端具有延长的单链，该延长的单链长度优选为16～20nt；
[0010]2、茎环结构中的环结构由15～25个碱基组成，茎结构的长度至少为4个碱基对；可以通过UNAFold等软件验证设计的RNA寡核苷酸是否具有茎环结构；
[0011]3、不同RNA寡核苷酸之间通过位于茎环结构5
’
或3
’
端的单链进行互补，自组装形成空间结构更加复杂的RNA自组装纳米材料；可以通过自由设计单链的序列，以碱基互补配对的原理，实现两种、三种甚至更多RNA寡核苷酸之间的组装(参见图2)；
[0012]4、RNA寡核苷酸序列为无义寡核苷酸序列，即应当与人类基因组、病毒基因组没有同源性。
[0013]基于上述RNA寡核苷酸，本专利技术提供了一种抑制HIV
‑
1病毒组装的方法，包括以下步骤：
[0014]1)设计能够自组装成具有多个茎环结构的RNA自组装纳米材料的至少两种RNA寡核苷酸，然后人工合成所述RNA寡核苷酸；
[0015]2)将步骤1)合成的多种RNA寡核苷酸在1
×
Tris缓冲液(100mM NaCl，50mM Tris，pH 8.0)中等摩尔浓度混合后，进行高温解链
‑
缓慢降温退火，通过各个RNA寡核苷酸单体中位于茎环结构5
’
或3
’
端的单链进行互补，从而实现自组装；然后对产物进行纯化，得到具有多个茎环结构的RNA自组装纳米材料；
[0016]3)用所述RNA自组装纳米材料转染感染了HIV
‑
1病毒的细胞，干扰细胞内HIV
‑
1病毒的组装。
[0017]步骤1)所设计的RNA寡核苷酸应为与人类基因组、病毒基因组没有同源性的无义寡核苷酸序列；具有茎环结构，并在茎环结构的5
’...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抑制HIV
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1病毒组装的方法，包括以下步骤：1)设计能够自组装成具有多个茎环结构的RNA自组装纳米材料的至少两种RNA寡核苷酸，然后人工合成所述RNA寡核苷酸；2)将步骤1)合成的多种RNA寡核苷酸在1
×
Tris缓冲液中等摩尔浓度混合，进行高温解链
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缓慢降温退火，实现自组装；然后对产物进行纯化，得到具有多个茎环结构的RNA自组装纳米材料；3)用所述RNA自组装纳米材料转染感染了HIV
‑
1病毒的细胞，干扰细胞内HIV
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1病毒的组装。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中所述RNA寡核苷酸为无义寡核苷酸序列，具有茎环结构，并在茎环结构的5
’
或3
’
端具有延长的单链；在步骤2)中，各个RNA寡核苷酸单体通过位于茎环结构5
’
或3
’
端延长的单链进行互补来实现自组装。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，两个RNA寡核苷酸单体通过位于茎环结构5
’
或3
’
端延长的单链进行互补，自组装形成哑铃形结构的RNA自组装纳米材料；或者，三个RNA寡核苷酸单体通过位于茎环结构5
’
或3
’
端延长的单链...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈匡时，曲娜，应亚宸，秦金珊，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：