一种菌的定性检测方法技术

本申请提供了一种菌的定性检测方法，包括：（1）获得菌种数对数与Ct值的标准曲线，得到Ct值的上限值C1和下限值C2、菌种数的上限值N1和下限值N2；其中，C1和N2对应，C2和N1对应；r2≥0.98；（2）将准确取样的待测液和阳性对照菌种液分别进行扩增培养，得到待测液扩增液和阳性对照菌种液扩增液，检测待测液扩增液的Ct值A和阳性对照菌种液扩增液的Ct值B；将待测液扩增液的Ct值A和阳性对照菌种液扩增液的Ct值B分别与上限值C1和下限值C2进行比较。本申请能够解决菌种数定量不准的问题，以及qPCR法因菌种数少DNA提取不稳定的问题。种数少DNA提取不稳定的问题。种数少DNA提取不稳定的问题。

【技术实现步骤摘要】
≥0.99；（b）测定第一菌种母液或第一稀释液的OD值，使其符合步骤（a）标准曲线的范围值；第一稀释液为第一菌种母液多次稀释后得到；（c）将符合范围值的第一菌种母液或第一稀释液进行10倍梯度稀释，得到阳性对照菌种液。
[0009]步骤（c）中，10倍梯度稀释的稀释倍数为：(0.01~5)
×
107；步骤（2）中准确取样的体积为150μL~250μL。
[0010]菌包括细菌或真菌；当菌为细菌时，步骤（c）中，10倍梯度稀释的稀释倍数为：(0.01~5)
×
107；步骤（2）中准确取样的体积为150μL~250μL；当菌为真菌时，步骤（c）中，10倍梯度稀释的稀释倍数为：(0.01~0.1)
×
107；步骤（2）中准确取样的体积为150μL~250μL。
[0011]可选地，步骤（b）还包括：测定第一菌种母液或的OD值是否符合步骤（a）标准曲线的范围值；如高于步骤（a）标准曲线的范围值，进行多次稀释，得到第一稀释液，直至第一稀释液的OD值符合步骤（a）标准曲线的范围值；将第一菌种母液或第一稀释液的OD值带入步骤（a）标准曲线，计算得到第一菌种母液或第一稀释液的理论浓度。
[0012]可选地，步骤（c）还包括：利用平皿涂布法，取样150μL~250μL的阳性对照菌种液，得到阳性对照菌种液的实际浓度；之后计算回收率，回收率的范围为80%~120%；回收率=实际浓度/理论浓度=（阳性对照菌种液的实际浓度
×
稀释倍数/第一菌种母液或第一稀释液的理论浓度）
×
100%。
[0013]可选地，步骤（a）标准曲线的绘制方法为：将菌种母液进行梯度稀释，利用平皿涂布法，计算菌浓度；以菌浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制浓度
‑
OD值的标准曲线。
[0014]可选地，阳性对照菌种母液扩增培养后得到阳性对照菌种母液扩增液，扩增培养的倍数为n；待测液和阳性对照菌种母液的准确取样体积均为V；检测阳性对照菌种母液的浓度为c2；将待测液扩增液的Ct值A和阳性对照菌种母液扩增液的Ct值B与上限值C1和下限值C2进行比较：当0<A≤C1时，若A≤B≤C1，该待测液的浓度c1为：N2/nV≤c1≤c2；若C2≤B<A，该待测液的浓度c1为：c2<c1≤N1/nV；若B<C2，该待测液的浓度c1为：c1>N1/nV。
[0015]可选地，扩增倍数n的范围为：(0.4~5.5)
×
103；扩增倍数n的计算方法包括：将利用平皿涂布法，取样150μL~250μL的阳性对照菌种母液扩增液，得到浓度c3；浓度c3与浓度c2的比值即为扩增倍数。
[0016]可选地，当菌为细菌时，扩增倍数n的范围为： (1.8~5.5)
×
103；当菌为真菌时，扩增倍数n的范围为： (0.4~1)
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103。
[0017]可选地，扩增培养的条件为：温度为20~40℃，时间为≥5.5h。
[0018]可选地，当菌为细菌时，扩增培养的条件为：温度为30~35℃，时间为≥5.5h；当菌为真菌时，扩增培养的条件为：温度为20~25℃，时间为10~24h。
[0019]可选地，扩增培养的条件为：温度为22.5℃或32.5℃，时间为≥5.5h。
[0020]可选地，当所述菌为细菌时，扩增培养的条件为：温度为32.5℃，时间为≥5.5h。
[0021]可选地，当所述菌为真菌时，扩增培养的条件为：温度为22.5℃，时间为≥10h。
[0022]可选地，步骤（1）包括：利用平皿涂布法将菌种母液进行梯度稀释，计算菌种数以及测Ct值；以菌种数的对数（lg菌种数）为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制菌种数对数
‑
Ct值的标准曲线。
[0023]与现有技术相对比，本申请存在有益效果：本申请先通过建立菌种母液标准曲线，限定菌的浓度范围，使其符合后续操作的
操作范围，并最终能够得到符合qPCR灵敏度的检测值；之后对稀释后的取样量（浓度和体积）进行准确度验证，确定准确取样的体积和浓度，克服现有技术中菌种数定量不准的难题；接着对经过准确度确认的菌种数进行扩增培养，使其符合后续qPCR的检测范围，并且能够解决因菌种数少DNA提取不稳定的问题；之后建立菌种数与Ct值的标曲，可以实现较低菌种数的检测，解决灵敏度低的问题，灵敏度最低可达到1cfu；即解决了原qPCR法方法验证时菌种数定量不准、DNA提取不稳定、灵敏度低的问题，可达到药品微生物检验替代方法验证指导原则中检测限每单位不超过5cfu的要求。且该方法从准备样品到检测结束，用时较短，不超过20h，一般为10h，不仅解决了药品无菌检验用时长的问题，还可满足货期短的药品的快速放行。
附图说明
[0024]图1为本申请一实施例大肠埃希菌的菌种数对数与Ct值的标准曲线图；横坐标为lg菌种数，无单位；纵坐标为Ct值，无单位。
[0025]图2为本申请一实施例大肠埃希菌的菌浓度和OD值的标准曲线图；横坐标为菌浓度，单位为cfu/mL；纵坐标为OD值，无单位。
[0026]图3为本申请一实施例铜绿假单胞菌的菌种数对数与Ct值的标准曲线图；横坐标为lg菌种数，无单位；纵坐标为Ct值，无单位。
[0027]图4为本申请一实施例铜绿假单胞菌的菌浓度和OD值的标准曲线图；横坐标为菌浓度，单位为cfu/mL；纵坐标为OD值，无单位。
[0028]图5为本申请一实施例金黄色葡萄球菌的菌种数对数与Ct值的标准曲线图；横坐标为lg菌种数，无单位；纵坐标为Ct值，无单位。
[0029]图6为本申请一实施例金黄色葡萄球菌的菌浓度和OD值的标准曲线图；横坐标为菌浓度，单位为cfu/mL；纵坐标为OD值，无单位。
[0030]图7为本申请一实施例枯草芽孢杆菌的菌种数对数与Ct值的标准曲线图；横坐标为lg菌种数，无单位；纵坐标为Ct值，无单位。
[0031]图8为本申请一实施例枯草芽孢杆菌的菌浓度和OD值的标准曲线图；横坐标为菌浓度，单位为cfu/mL；纵坐标为OD值，无单位。
[0032]图9为本申请一实施例生孢梭菌的菌种数对数与Ct值的标准曲线图；横坐标为lg菌种数，无单位；纵坐标为Ct值，无单位。
[0033]图10为本申请一实施例生孢梭菌的菌浓度和OD值的标准曲线图；横坐标为菌浓度，单位为cfu/mL；纵坐标为OD值，无单位。
[0034]图11为本申请一实施例白色念珠菌的菌种数对数与Ct值的标准曲线图；横坐标为lg菌种数，无单位；纵坐标为Ct值，无单位。
[0035]图12为本申请一实施例白色念珠菌的菌浓度和OD值的标准曲线图；横坐标为菌浓度，单位为cfu/mL；纵坐标为OD值，无单位。
[0036]图13为本申请一实施例黑曲霉的菌种数对数与Ct值的标准曲线图；横坐标为lg菌种数，无单位；纵坐本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种菌的定性检测方法，其特征在于，所述方法包括：（1）获得菌种数对数与Ct值的标准曲线，得到Ct值的上限值C1和下限值C2、菌种数的上限值N1和下限值N2；其中，C1和N2对应，C2和N1对应；r2≥0.98；（2）将准确取样的待测液和阳性对照菌种液分别进行扩增培养，得到待测液扩增液和阳性对照菌种液扩增液，检测待测液扩增液的Ct值A和阳性对照菌种液扩增液的Ct值B；将待测液扩增液的Ct值A和阳性对照菌种液扩增液的Ct值B分别与上限值C1和下限值C2进行比较：当0<B≤C1时，若0<A≤C1，结果呈阳性，该待测液中含有菌；若A>C1，结果呈阴性，该待测液中不含菌。2.根据权利要求1所述的定性检测方法，其特征在于，阳性对照菌种液的制备方法包括：（a）获得菌浓度和OD值的标准曲线，r2≥0.99；（b）测定第一菌种母液或第一稀释液的OD值，使其符合步骤（a）标准曲线的范围值；第一稀释液为第一菌种母液多次稀释后得到；（c）将符合范围值的第一菌种母液或第一稀释液进行10倍梯度稀释，得到阳性对照菌种液。3.根据权利要求2所述的定性检测方法，其特征在于，步骤（c）中，10倍梯度稀释的稀释倍数为：(0.01~5)
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107；步骤（2）中准确取样的体积为150μL~250μL。4.根据权利要求2所述的定性检测方法，其特征在于，菌包括细菌或真菌；当菌为细菌时，步骤（c）中，10倍梯度稀释的稀释倍数为：(0.01~5)
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107；步骤（2）中准确取样的体积为150μL~250μL；当菌为真菌时，步骤（c）中，10倍梯度稀释的稀释倍数为：(0.01~0.1)
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107；步骤（2）中准确取样的体积为150μL~250μL。5.根据权利要求2所述的定性检测方法，其特征在于，步骤（b）还包括：测定第一菌种母液的OD值是否符合步骤（a）标准曲线的范围值；如高于步骤（a）标准曲线的范围值，需进行多次稀释，得到第一稀释液，直至第一稀释液的OD值符合步骤（a）标准曲线的范围值；将第一菌种母液或第一稀释液的OD值代入步骤（a）标准曲线，计算得到第一菌种母液或第一稀释液的理论浓度。6.根据权利要求2所述的定性检测方法，其特征在于，步骤（c）还包括：利用平皿涂布法，取样150μL~250μL的阳性对照菌种液，得到阳性对照菌种液的实际浓度；之后计算回收率...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹璇，苏月焱，王广基，蒲志青，郭佳祺，张月，
申请(专利权)人：江苏睿源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：