一种用于提高菌丝霉素Plectasin高密度发酵的方法技术

本发明专利技术公开了一种用于提高菌丝霉素Plectasin高密度发酵的方法，该发酵方法在BMMY培养基、溶解氧（DO）上进行优化，上述BMMY培养基配方为按6L的体系培养该培养基，取葡萄糖30g/L、胰蛋白胨21.67g/L、酵母提取物11.67g/L、PH 6.0磷酸钾缓冲液500mL、10xYNB 600mL、0.02%生物素12mL，余量为去离子水；该方法生长阶段各条件为：温度30℃、DO 30%

【技术实现步骤摘要】
一种用于提高菌丝霉素Plectasin高密度发酵的方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于提高菌丝霉素Plectasin高密度发酵的方法。

技术介绍

[0002]菌丝霉素Plectasin是从腐生子囊菌分泌蛋白中筛选分离得到的首例真菌防御素类抗菌肽。研究表明，菌丝霉素具有较强的抗革兰氏阳性菌，且无溶血性，能够作为一种治疗革兰氏阳性菌感染的非抗生素类药物。但天然菌丝霉素Plectasin分离纯化成本高，且产量较低，大大限制了其应用。近年来，利用基因工程技术，通过蛋白质高效异源表达系统的构建，为实现其廉价生产提供了一条有效的途径。为进一步提高重组菌丝霉素Plectasin分泌水平，本专利技术提出一种用于提高菌丝霉素Plectasin高密度发酵的方法。

技术实现思路

[0003]本专利技术是提供一种用于提高菌丝霉素Plectasin高密度发酵的方法，该发酵方法在BMMY培养基、溶解氧（DO）上进行优化，提高了重组菌丝霉素Plectasin分泌水平，成本低，能够作为规模化生产。
[0004]本专利技术采用以下技术方案：一、对菌丝霉素Plectasin进行发酵培养（1）发酵培养前的准备：对菌丝霉素Plectasin菌株进行活化，挑取单克隆接种于一级种子液培养基中进行培养，OD600值在1.7
‑
1.9时转接二级种子液培养基，接种量为1%
‑
2%，将接种好的二级种子液培养基继续摇培14h
‑
16h，OD600在1.8
‑<br/>2.0时即可转入发酵罐中进行发酵。
[0005]（2）对发酵罐罐体进行空消后冷却至常温，将配置好的BMMY培养基倒入发酵罐中，121℃灭菌30min，冷却至29℃
‑
30℃，设定PH值、溶解氧等条件，再将摇培好的二级种子液、10xYNB、0.02%生物素于发酵罐接种口中倒入发酵罐中，进行发酵培养120h
‑
160h。
[0006]（3）生长阶段条件设置为30℃、PH 5.0、溶氧维持在27%
‑
33%之间，生长阶段发酵时间24h，当菌株浓度达到诱导的标准时停止补料，并立即进行饥饿培养1h
‑
1.5h；饥饿培养结束后即进入诱导阶段，温度为25℃
‑
30℃，PH 5.0，溶氧为15%
‑
40%之间，诱导阶段首先按0.3%/（0
‑
2）h、0.4%/（3
‑
4）h、0.5%/（5
‑
6）h流加甲醇+山梨醇，甲醇+山梨醇流加结束后立即按0.5%/2h持续流加甲醇，每12h取样做抑菌实验，观察实验结果，若抑菌活性降低则结束发酵。
[0007]（4）将发酵液离心取上清液，将离心好的上清液过膜过滤，保留目标分子，然后制备成菌丝霉素Plectasin粗品。
[0008]其中，一级种子液和二级种子液培养基配制方法为：取葡萄糖 200g/L、胰蛋白胨 20g/L、酵母提取物 11g/L，将葡萄糖加去离子水溶解完成后定容至1L，108℃灭菌30min待用；在称量好胰蛋白胨、酵母提取物中加入离子水搅拌均匀，121℃灭菌30min，自然冷却至
常温，在无菌超净工作台按1:3的比例加入灭菌好的葡萄糖，制得一级种子液培养基和二级种子液培养基。
[0009]优选的，BMMY培养基配制方法：按6L的体系培养该培养基，取葡萄糖 30~33.2g/L、胰蛋白胨 20~23.3g/L、酵母提取物 10~13.3g/L、PH 6.0磷酸钾缓冲液 400~600mL、10xYNB 600mL、0.02%生物素 12mL,采用常规方法制备培养基，将配置好的培养基加去离子水搅拌均匀，在发酵罐中121℃灭菌30min，灭菌完成后开启冷却设备用无菌空气降温，冷却至30℃，制得10L发酵罐培养基。
[0010]优选的，BMMY培养基配方为：按6L的体系培养该培养基，取葡萄糖 30g/L、胰蛋白胨 21.67g/L、酵母提取物 11.67g/L、PH 6.0磷酸钾缓冲液 500mL、10xYNB 600mL、0.02%生物素 12mL，余量为去离子水。
[0011]优选的，所述生长阶段各条件为：温度 30℃、DO 30%
±
3%、PH 5.0。
[0012]优选的，所述诱导阶段各条件为：温度 25℃、DO 25%
±
2%、PH 5.0 。
[0013]其中，磷酸钾缓冲液配制方法：取磷酸二氢钾 136g/L、磷酸氢二钾 228.2g/L，将配置好的溶液倒入容器中，用磷酸二氢钾调节溶液PH至6.0。
[0014]其中，10xYNB配制方法如下：取硫酸铵 100g/L、生物素4mg/L、泛酸钙 8mg/L、叶酸 4mg/L、肌醇 40mg/L、烟酸 8mg/L、对羟基苯甲酸 4mg/L、盐酸吡哆辛8mg/L、核黄素 4mg/L、盐酸硫胺素 8mg/L、硼酸 10mg/L、硫酸铜 0.8mg/L、碘化钾 2mg/L、三氯化铁 4mg/L、硫酸锰 8mg/L、硫酸锌 8mg/L、钼酸钠 4mg/L、磷酸二氢钾 20g/L、硫酸镁 10g/L、氯化钠 2g/L、氯化钙 2g/L，加去离子水搅拌溶解等溶解完成后定容至1L备用。
[0015]本专利技术所提供的方法的优势是：本专利技术在对BMMY培养基、溶解氧（DO）、温度及PH值上进行优化后，显著提高了重组菌丝霉素分泌水平，且操作简单，成本低，能够为规模化生产打下基础。
附图说明
[0016]图1：实施例1具体发酵条件下10L发酵罐的发酵上清液对金黄色葡萄球菌抑菌实验平板结果图。
[0017]图2：实施例2具体发酵条件下10L发酵罐的发酵上清液对金黄色葡萄球菌抑菌实验平板结果图。
[0018]图3：实施例3具体发酵条件下10L发酵罐的发酵上清液对金黄色葡萄球菌抑菌实验平板结果图。
[0019]图4：实施例4具体发酵条件下10L发酵罐的发酵上清液对金黄色葡萄球菌抑菌实验平板结果图。
[0020]图5：实施例5具体发酵条件下100L发酵罐的发酵上清液对金黄色葡萄球菌抑菌实验平板结果图。
具体实施方式
[0021]本专利技术提供一种用于提高菌丝霉素Plectasin高密度发酵的方法，下面结合附图进行具体说明。
[0022]胰蛋白胨、酵母提取物购于北京鸿润宝顺科技有限公司；
磷酸氢二钾、磷酸二氢钾购于四川金地亚美科技有限公司：硫酸铵、无水甲醇、生物素、硼酸、硫酸铜、碘化钾、三氯化铁、硫酸锰、硫酸锌、钼酸钠、硫酸镁、氯化钠、氯化钙、琼脂购于国药集团化学试剂有限公司；葡萄糖购于齐齐哈尔龙江阜丰生物科技有限公司：10xYNB为复配试剂级，除以上标注外，其他原料均购于上海麦克林生化科技有限公司；以下5种试剂：胰蛋白胨、酵母提取物、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、葡萄糖均为食品级试剂；除以上特别指明外，本专利技术以下实施例所用的试剂均为分本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于提高菌丝霉素Plectasin高密度发酵的方法，具体特征在于：（1）、对菌丝霉素Plectasin进行发酵培养
①
发酵培养前的准备：对菌丝霉素Plectasin菌株进行活化，挑取单克隆接种于一级种子液培养基中进行培养，OD600值在1.7
‑
1.9时转接二级种子液培养基，接种量为1%
‑
2%，将接种好的二级种子液培养基继续摇培14h
‑
16h，OD600在1.8
‑
2.0时即可转入发酵罐中进行发酵；
②
对发酵罐罐体进行空消后冷却至常温，将配置好的BMMY培养基倒入发酵罐中，121℃灭菌30min，冷却至29℃
‑
30℃，设定PH值、溶解氧等条件，再将摇培好的二级种子液、10xYNB、0.02%生物素于发酵罐接种口中倒入发酵罐中，进行发酵培养120h
‑
160h；
③
生长阶段条件设置为30℃、PH 5.0、溶氧维持在27%
‑
33%之间，生长阶段发酵时间24h，当菌株浓度达到诱导的标准时停止补料，并立即进行饥饿培养1h
‑
1.5h；饥饿培养结束后即进入诱导阶段，温度为25℃
‑
30℃，PH 5.0，溶氧为15%
‑
40%之间，诱导阶段首先按0.3%/（0
‑
2）h、0.4%/（3
‑...

【专利技术属性】
技术研发人员：喻诗，朱新鹏，吴杭，丁冬，钱晓明，
申请(专利权)人：江苏亢钧生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：