多拷贝整合与高密度发酵合成短吻鳄抗菌肽AM-CATH的方法技术

本发明专利技术公开了多拷贝整合与高密度发酵合成短吻鳄抗菌肽AM

【技术实现步骤摘要】
多拷贝整合与高密度发酵合成短吻鳄抗菌肽AM
‑
CATH的方法


[0001]本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及多拷贝整合与高密度发酵合成短吻鳄抗菌肽AM
‑
CATH的方法。

技术介绍

[0002]短吻鳄抗菌肽AM
‑
CATH是从美国短吻鳄（Alligator mississippiensis）发现了的一种抗菌肽，其由一个N端的α
‑
螺旋和一个中心脯氨酸铰链组成。抗菌肽AM
‑
CATH以及其两个截短肽对多种革兰氏阴性菌，包括临床分离的多重耐药鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）和耐碳青霉烯肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）有较强的抑菌活性。使用溴化乙二胺吸收试验，发现这些肽可透过细菌细胞膜，对盐抑制的敏感性低于许多其他已知的肽链。在3
‑
(4,5
‑
二甲基噻唑
‑2‑
基)
‑
2,5
‑
二苯基四唑溴化铵（MTT）作用24小时后，短吻鳄抗菌肽AM
‑
CATH对绵羊红细胞无溶血作用，对A549人肺上皮细胞无明显细胞毒性。与人类的LL
‑
37相似，短吻鳄抗菌肽cathelicidins可能在短吻鳄的先天免疫反应中发挥重要作用。
[0003]目前，无论是通过化学合成或者生物合成方法合成短吻鳄抗菌肽AM
‑
CATH，所获得的短吻鳄抗菌肽AM
‑
CATH产量都无法满足实际工业使用中的需求。本专利技术采用短吻鳄抗菌肽基因，将其通过酶切酶连形成多拷贝基因，构建酵母表达的重组质粒，建立酵母表达系统用于获取短吻鳄抗菌肽。

技术实现思路

[0004]本专利技术通过采用基因工程技术，构建串联两拷贝的质粒，以毕赤酵母为宿主，通过发酵工艺优化，实现短吻鳄抗菌肽AM
‑
CATH的高水平合成。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0006]1）将短吻鳄抗菌肽AM
‑
CATH全基因合成并插入到pPICZαA载体上，成功构建单拷贝AM
‑
CATH
‑
pPICZαA重组质粒，分别利用两组限制性内切酶对单拷贝重组质粒进行双酶切，获得两段包含有抗菌肽AM
‑
CATH的基因片段；同时对pPICZαA质粒进行双酶切，回收酶切后的线性化质粒；2）利用T4连接酶，将双酶切后获得的目的片段进行连接，随后将连接产物与双酶切后回收的pPICZαA质粒进行连接，获得两拷贝数的重组表达载体，对连接产物进行鉴定；3）将含测序正确的重组质粒的菌株划线培养，挑取单克隆添加到LB培养基中，37℃ 180rpm摇培12h，然后利用试剂盒提取重组质粒。
[0007]1）将重组表达载体转入毕赤酵母中，筛选重组酵母表达菌；2）对同源重组成功的毕赤酵母进行诱导表达，从而得到分泌表达的两拷贝短吻鳄抗菌肽AM
‑
CATH蛋白。
[0008]优选的，所述的pPICZαA表达载体构建包括以下内容：pPICZαA载体的酶切及酶切产物回收；短吻鳄抗菌肽AM
‑
CATH序列和载体的连接；连接产物的鉴定。
[0009]优选的，所述的连接产物的鉴定包括制备感受态细胞、转化反应、重组质粒提取和鉴定。
[0010]其中，所述的短吻鳄抗菌肽AM
‑
CATH基因的核苷酸序列可以是任何一种基因的核苷酸序列；核苷酸序列是通过毕赤酵母密码子偏好性优化后的核苷酸序列。
[0011]本专利技术选用毕赤酵母为宿主菌。毕赤酵母具有真核生物特有的蛋白高效分泌表达，翻译后修饰，因此，近年来毕赤酵母成为表达外源目的蛋白，特别是真核来源的外源蛋白的高效表达系统。
[0012]本专利技术对提取的重组质粒酶切线性化后电转化X33毕赤酵母感受态细胞，转化后的细胞涂布于YPD平板，挑选单克隆，对克隆进行小量发酵培养，发酵液采用SDS
‑
PAGE分离后，以获得表达短吻鳄抗菌肽AM
‑
CATH的发酵液蛋白。发酵液蛋白经Ni
‑
NTA琼脂糖树脂亲和层析后，使用相应的蛋白酶进行切割，再对所得到的短吻鳄抗菌肽AM
‑
CATH纯化。
[0013]本专利技术的有益效果在于：（1）本专利技术采用酵母表达短吻鳄抗菌肽AM
‑
CATH时，通过串联两拷贝的方式，将短吻鳄抗菌肽AM
‑
CATH表达产量提高2
‑
3倍。
[0014]（2）本专利技术采用基因工程技术，构建串联两拷贝的质粒，以毕赤酵母为宿主，成功表达两拷贝串联蛋白；本专利技术提供的方法具有通用性强、表达效率较高、具有生物活性、成本低、易规模化生产等优点。
[0015]（3）本专利技术相较于短吻鳄抗菌肽AM
‑
CATH的单拷贝表达，使得短吻鳄抗菌肽AM
‑
CATH的产量提高2
‑
3倍，且并未增加生产工序，生产成本与单拷贝表达的成本基本持平。
附图说明
[0016]图1为短吻鳄抗菌肽单拷贝基因全合成图；图2为两拷贝载体的构建的方案设计图；图3为抑菌活性实验结果图，短吻鳄抗菌肽AM
‑
CATH对大肠杆菌（E. coli）的抑菌结果，左图为单拷贝AM
‑
CATH抑菌结果，右图为两拷贝AM
‑
CATH抑菌结果；编号1
‑
6代表6组发酵罐号，发酵诱导表达培养时间为96h。
[0017]图4为短吻鳄抗菌肽AM
‑
CATH对金黄色葡萄球菌（S. aureus）的抑菌结果，左图为单拷贝AM
‑
CATH抑菌结果，右图为两拷贝AM
‑
CATH抑菌结果；编号1
‑
6代表6组发酵罐号，发酵诱导表达培养时间为96h。
具体实施方式
[0018]为了使本专利技术所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本专利技术所述的技术方案做进一步的说明，但是本专利技术不仅限于此。
[0019]蛋白胨Peptone、硫酸铵、甲醇、琼脂、葡萄糖、磷酸钾缓冲液、甘油、山梨醇购于国药集团化学试剂有限公司；YNB购于北京索莱宝科技有限公司；酵母提取物Yeast extract购于OXOID公司；细菌菌株购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
[0020]除非特别指明，本专利技术以下实施例所用的试剂均为分析纯试剂，且可从常规渠道
商购获得。
[0021]本专利技术中的YPD培养基的配制: 酵母提取物Yeast extract 1%,蛋白胨Peptone 2%, 葡萄糖 2%，固体培养基则添加琼脂粉 2%。
[0022]本专利技术中的BMMY培养基的配制：酵母提取物Yeast extract 2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.多拷贝整合与高密度发酵合成短吻鳄抗菌肽AM
‑
CATH的方法，其特征在于包括以下步骤：A、构建重组短吻鳄抗菌肽AM
‑
CATH多拷贝表达载体1）将短吻鳄抗菌肽AM
‑
CATH全基因合成并插入到pPICZαA载体上，成功构建单拷贝AM
‑
CATH
‑
pPICZαA重组质粒，分别利用两组限制性内切酶对单拷贝重组质粒进行双酶切，获得两段包含有抗菌肽AM
‑
CATH的基因片段；同时对pPICZαA质粒进行双酶切，回收酶切后的线性化质粒；2）利用T4连接酶，将双酶切后获得的目的片段进行连接，随后将连接产物与双酶切后回收的pPICZαA质粒进行连接，PCR扩增，获得两拷贝数的重组表达载体，对重组表达载体进行鉴定；3）将含测序正确的重组质粒的菌株划线培养，挑取单克隆添加到LB培养基中，37℃ 180rpm摇培12h，然后利用试剂盒提取重组质粒；B、重组短吻鳄抗菌肽AM
‑
CATH菌株的制备1）将重组表达载体转入毕赤酵母中，筛选重组酵母表达菌株；2）对同源重组成功的毕赤...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘杰，丁冬，张婷婷，朱春生，储欣悦，
申请(专利权)人：江苏亢钧生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：